Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
Gedrag wordt bestuurd door het zenuwstelsel. Calcium beeldvorming is een eenvoudige werkwijze in de transparante nematode Caenorhabditis elegans om de activiteit van neuronen in verschillende gedragingen meten. Neurale activiteit correleert met gedragstherapie, dient het dier niet wordt geïmmobiliseerd maar moeten kunnen bewegen. Veel gedragsveranderingen optreden tijdens lange tijdschalen en vereisen opnemen gedurende vele uren van gedrag. Dit maakt het ook noodzakelijk om de cultuur van de wormen in de aanwezigheid van voedsel. Hoe kunnen wormen worden gekweekt en hun neurale activiteit afgebeeld over langere tijdschalen? Agarose microkamer Imaging (AMI) was eerder ontwikkeld om de cultuur en observeren kleine larven en is nu aangepast om alle levensfasen van de vroege L1 bestuderen totdat het volwassen stadium van C. elegans. AMI kan worden uitgevoerd op verschillende levensstadia van C. elegans. Langdurige calcium beeldvorming wordt bereikt zonder immobiliseren de dieren met behulp van korte extern getriggerd blootstellingen comgecombineerd met een elektron-charge-coupled device (EMCCD) camera-opname te vermenigvuldigen. Uitzoomen of scannen kan opschalen van deze methode om de afbeelding tot 40 wormen in parallel. Aldus wordt een werkwijze beschreven voor het gedrag en de neurale activiteit op langere tijdschalen in alle levensfasen van C. elegans.
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
Hardware
De focus van een microscoop zal doorgaans drift tijdens langdurige beeldacquisitie. Voor samengestelde microscopen, concentreren-het houden van systemen kunnen worden gekocht bij de grote microscoop fabrikanten. Wanneer een samengestelde microscoop met focusbesturing te duur zou een eenvoudig alternatief een stereomicroscoop gebruiken. Verbinding microscopen maken het gebruik van doelen met een hoge numerieke apertuur (NA) en kan gemakkelijk worden geautomatiseerd. 40X olie doelstellingen zijn zeer geschikt. Waterimmersie lenzen zijn niet ideaal vanwege verdamping gedurende langdurige imaging. Differentieel interferentie contrast (DIC) vormt een mooi contrast dat helpt om morfologische en gedragsveranderingen te volgen, maar eenvoudige helderveld beeldvorming kan worden gebruikt. Voor DIC of heldere veld imaging, gebruiken rood licht door het plaatsen van een rood licht filter in de dia-verlichting pad van de microscoop. Voor het scannen van verscheidene microkamers een geautomatiseerd fase noodzakelijk. Beste prestaties is achieved wanneer een trap wordt gebruikt dat lineaire versnelling en vertraging heeft en kan worden ingesteld op lage scansnelheid te voorkomen tijdens het scannen de dieren te storen. We hebben geen gedragsreacties of calcium verhoging mechanosensitieve neuronen (ALM en PLM) tijdens het scannen, wat suggereert dat langzame scan inderdaad geen mechanosensitieve stelsel van de worm te activeren waargenomen (gegevens niet getoond). Commerciële LED kunnen worden gebruikt. Verschillende bedrijven bieden kant-en-klare oplossingen die de LED's bij verschillende golflengten omvatten. De LED moet de mogelijkheid van extern triggering de LED met een TTL-signaal. Een zeer gevoelige camera nodig op calcium beeldvorming van bewegende dieren. EMCCD's zijn de meest gevoelige camera's op de markt. De camera dient een TTL-uitgang tijdens blootstelling (ook wel "fire" output) hebben. Een deksel verwarmingselement dient om condensatie op het deksel te voorkomen bij gebruik van een omgekeerde microscoop. Aan een rechtopstaande microscoop, wordt de schaal gelegd zodat het deksel will onderaan en dus condensatie wordt voorkomen en geen deksel verwarmen. Het deksel moet goed sluiten de schotel om verdamping van water tijdens langdurige imaging voorkomen.
PDMS postzegels
Het oppervlak van PDMS stempel dat de structuur voor het vormen van de agarose bevat wordt verwijderd van het glasplaatje, waarbij de PDMS stempel steunt geconfronteerd. Een lijst met bedrijven die aangepaste microfluïdische chips bieden is te vinden op Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Het vullen van de aaltjes in hun kamers
Dit is de meest cruciale stap in het protocol en de volgende punten moeten worden overwogen: A) De vochtigheid van de agarose is cruciaal voor de overdracht van de wormen en voor de beeldvorming. Wanneer de agarose te vochtig, dwz een liquide covering een gebied van enkele microkamers, zal het niet mogelijk zijn om bacteriële voedsel en wormen distribueren gecontroleerd omdat de vloeistof zal de bacteriën wegvloeien. Wanneer de agarose te droog is dan de bacteriën en wormen niet van de pick eenvoudig betekent dat meer kracht gebruikt moet worden om de wormen en bacteriën die gemakkelijk schade veroorzaakt aan de agarose vallen. Bij het invullen van veel wormen de agarose kunnen opdrogen. In het ergste geval wordt de agarose zo droog uiteindelijk dat de kamers zullen bezwijken. Wanneer de agarose te droog kan worden gerehydrateerd door een kleine druppel (ongeveer 2 pl) van S-Basal op de zijkant van de chip waar geen wormen. Dompel de platinadraad halen in de vloeistof en zelfs de vloeistof te trekken in het gebied waar de kamers worden gevuld met wormen. B) De hoeveelheid voedsel is essentieel voor een succesvolle langdurige imaging. Als er niet genoeg voedsel, kan de wormen uit het uit te voeren. Als er teveel voedsel in de holte van de kamerniet gedragen als een vloeistof, maar veeleer als een stevig en zal wormen te ontsnappen uit de kamer door afzetten van de bacteriën. Streven naar een bacteriële suspensie dat de hele kamer vult verkrijgen. De wormen zijn constant fysiek contact met de agar en glasoppervlakken langs het grootste deel van hun lengte gedurende het experiment en de kruipende gedrag lijkt vergelijkbaar met beweging op een plaat en ongelijk aan dorsen vloeibaar zijn. C) Mechanische beschadiging van de agarose kan het experiment ruïneren. Een fijne keuze is essentieel. Het moet geen scherpe hoeken. Een zachte wimpers bevestigd aan een pipetpunt kan worden gebruikt om bacteriën of wormen verplaatsen in de kamers in plaats van een platina oogst. In de meeste gevallen echter extra gedroogde agarose is de oorzaak van schade. De pick of wimpers moet idealiter alleen nauwelijks raken de agarose zelf, en het water film op de agarose oppervlak moet trekken uit wormen en bacteriën. Bij het afdichten van de kamers, nogmaals, het vocht van de agarose essentieel. Er moet nietzijn geen vrije vloeistof op de agarose oppervlak, omdat deze weg bacteriën en wormen tijdens het afdichten kunnen wassen. Grote bellen kunnen worden verwijderd door voorzichtig een tipje van de agar plaat. Kleine belletjes die kleiner zijn dan de kamer vaak vast komen te zitten in de kamers. Deze belletjes zijn geen probleem en zal verdwijnen door absorptie. Na het monteren van de schotel, opnieuw controleren dat de agarose niet te droog of te nat. De kamers moeten netjes worden afgesloten en er mag geen vloeistofstroom tussen de kamers zijn. Als de agarose te nat is, zullen de kamers niet goed af. Wormen kunnen ontsnappen of hun voedsel zal worden weggespoeld. Als het monster is te vochtig, eenvoudig open het deksel en laat de agarose drogen voor een minuut of twee. Als de agarose te droog is, kunnen de kamers instorten en de wormen zullen ontsnappen.
Opschalen door in te zoomen op
Voor fluorescentie beeldvorming, uitzoomen wordt beperkt door de lage hoeveelheid licht verkregen bij lagere vergrotingen. Ook, EMCCD camera zijn geoptimaliseerd voor gevoeligheid en hebben vaak een relatief lage resolutie. Echter, het opschalen van imaging viervoudige is goed mogelijk. Zo kunnen vier kamers van 190 micrometer x 190 micrometer passen op één frame wanneer u 140x vergroting (bereikt door het gebruik van een 20X Doel en een 0,7X camera mount) en een 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm camera. Een hoge-resolutie camera met een grote chip (zoals sCMOS camera's, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 megapixels) optimaliseert het opschalen van DIC en lichte field imaging. Bijvoorbeeld, tot 30 L1 wormen in 190 urn x 190 urn kamers passen op elk frame van de camera bij gebruik van een 100x vergroting (zie figuur 3). In principe uitzoomen en scanning kan ook gecombineerd worden om nog grotere aantallen dieren te verkrijgen. De meeste neuronen blijven vrij goed in focus, zodat slechts een focal plane moet worden afgebeeld. Als neuronen worden gevonden om uit te gaan van de focus, az scan met een piëzo-station kan worden genomen op elk tijdstip point.
Aanpassing aan verschillende gedragingen
Dit protocol geeft een goed beeld van het gedrag over lange tijdschalen. Uiteraard is de timing van de bursts moet worden aangepast aan verschillende gedragingen en ontwikkelingsstadia.
Beperkingen van de techniek
Verscheidene factoren beperken de duur van beeldvorming. De belangrijkste is de hoeveelheid voedsel. Zodra het voedsel wordt geconsumeerd, larven stoppen met het ontwikkelen. Dus, in kleine kamers (190 x 190 micrometer) wormen ontwikkelen tot het L3 stadium en dan arresteren. Indien langere beeldvorming vereist is, groter compartimenten moet gebruiken. De maximale duur van het langdurige beeldvorming in het bereik van 2,5-3 dagen. Als langer beeldvorming nodig is, moeten de wormen te vorderen en geplaatst in de nieuwe kamers. Bij beeldvorming volwassen wormen, wordt een beperking veroorzaakt door het nageslacht van deze wormen. Volwassen wormen leggen eieren waaruit larven komen. Deze larven zullen ook in de kamer te blijven, Voedsel consumeren, en kan de beeldanalyse verstoren. Als nakomelingen problemen een oplossing is om ofwel gebruik steriel volwassenen of herhaaldelijk plaats de wormen in de frisse kamers. Om wormen te herstellen, wordt de agarose plaat bevat de kamer vrij gesneden met een scalpel, wordt getrokken uit het dekglaasje, en wordt geplaatst op een NGM plaat waaruit de wormen kunnen worden hersteld. Een andere beperking is de beperking van de wormen relatief kleine gebieden. Dit kan een probleem zijn als lange-afstands beweging moet worden geanalyseerd. Terwijl dieren in de kamers mechanisch als optogenetically 21,27,34,35 kan worden gestimuleerd, wordt de afgedichte aard van de kamer maakt het moeilijk oplosbare of vluchtige stimulerende toepassen. Biologisch belangrijke gassen zoals zuurstof of kooldioxide vrij diffunderen in de agar. De grote lucht reservoir in de schaal moet de concentratie gas in de kamers constant over de tijd die nodig is voor de experimenten te houden. Er moet echter rekening mee dat de lokale zuurstof concentratio worden gehoudenn in de kamer kan meer lijken op de omstandigheden in vloeibare cultuur dan de cultuur op het bord.
Belang met betrekking tot bestaande methoden
Microfluïdische apparaten zijn sterk geavanceerde gedrags- en ontwikkelingsstoornissen studeerde in C. elegans. Vaak worden microfluïdische structuren gemaakt van PDMS 12. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van microfluïdische cultuur raakvlakken gemaakt van agarose. De kracht van deze techniek is de combinatie van hoge afbeeldingkwaliteit, correlatie van gedrag fysiologische metingen, langdurige imaging en een redelijk hoge doorvoer. Hoge beeldkwaliteit wordt bereikt door beeldvorming door het glas dekglaasje met behulp van hoge NA doelstellingen. Hierdoor kan fluorescentie beeldvorming zoals calcium beeldvorming en confocale beeldvorming van subcellulaire structuren worden uitgevoerd. Doordat de dieren niet geïmmobiliseerd zoals in andere systemen, laat een correlatie van gedrag fysiologische metingen. Because de dieren voldoende voedsel, blijven ze ontwikkelen waardoor de lange termijn imaging. Dit systeem kan afbeelding veel wormen in één run omdat de dieren zijn beperkt tot hun gedefinieerde kamers. Zo kan deze werkwijze gemakkelijk worden opgeschaald 9,27,34-36.
Toekomstige toepassingen
Tot dusver is dit systeem voornamelijk gebruikt om slaapgedrag bestuderen in C. elegans L1 larven. Toch zal de aanpassing aan alle fasen het mogelijk om verschillende gedragingen ook onderzoek in dauers en volwassenen. Een breed scala aan gedragingen kunnen worden bestudeerd met deze techniek, variërend van paring tot het leggen van eieren.
The authors have nothing to disclose.
Het Max Planck Society en een Göttingen Graduate School Junior Group stipendium om HB gefinancierd dit werk.
high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
LED system | CoolLED | pE-2 | |
compound microscope | Nikon | TiE | |
stereomicroscope | Leica | M5 | |
EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
lid heater | MPI workshop | custom made | |
plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
red light filter | Chroma | ET660/50m | |
35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |