의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em> 예쁜 꼬마 선충</em
Summary
Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
Abstract
동작은 신경계에 의해 조절된다. 칼슘 이미징 Caenorhabditis 엘레 다양한 동작 중에 뉴런의 활성을 측정하기 위해 투명 간스 선충에 간단한 방법이다. 행동 신경 활동의 상관 관계, 동물 고정화되지 않아야하지만 이동할 수 있어야한다. 많은 행동 변화는 긴 시간 규모 동안 발생과 행동의 많은 시간 동안 기록이 필요합니다. 이것은 또한 배양하는 데 필요한 식품의 존재에 웜을 만든다. 어떻게 웜 배양과 신경 활동은 긴 시간 규모에 걸쳐 영상화 할 수 있습니까? 아가로 오스 Microchamber 이미지 (AMI)는 이전에 문화를 개발하고 작은 유충을 관찰하고 지금 C의 성인 무대까지 초기 (L1)의 모든 삶의 단계를 연구하도록되어 있었다 엘레. AMI는 C의 다양한 삶의 단계에서 수행 할 수 있습니다 엘레. 장기 칼슘 이미징 COM 짧은 노출 외부 트리거를 사용하여 동물을 고정하지 않고 달성된다전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 녹화 전자 증배 bined. 축소 또는 스캔은 병렬로 40 벌레까지 이미지에이 방법을 확장 할 수 있습니다. 따라서, 방법은 C의 모든 삶의 단계에 긴 시간 규모에 걸쳐 이미지의 행동과 신경 활동에 설명 엘레.
Introduction
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
Protocol
Representative Results
Discussion
하드웨어
현미경의 초점은 전형적으로 장기간의 화상 획득 동안에 드리프트 할 것이다. 복합 현미경, 초점을 지키는 시스템하는 주요 현미경 제조 업체에서 구입하실 수 있습니다. 포커스 제어와 화합물 현미경 너무 비싼 인 경우에, 간단한 대안은 실체 현미경을 사용하는 것이다. 화합물 현미경은 높은 개구 수 (NA)가 목표의 사용을 허용하고 용이하게 자동화 될 수있다. 40X 오일 목표는 적합하다. 침수 렌즈 때문에 장기 이미징 동안 증발의 이상적인 수 없습니다. 미분 간섭 대비 (DIC)는 형태 학적 및 행동 변화를 수행하는 데 도움이 좋은 대비를 생성하지만 간단한 시야 촬상 또한 사용될 수있다. DIC 또는 시야 이미징, 현미경의 직경 – 조명 경로로 붉은 빛이 필터를 배치하여 붉은 빛을 사용합니다. 여러 microchambers 스캐닝하기위한 자동화 단계가 필요하다. 최고의 성능을 교류입니다스테이지 비선형 가속과 감속을 가지며, 주사시 동물을 방해하지 않도록 낮은 주사 속도로 설정 될 수 사용될 때 hieved. 우리는 웜의 mechanosensitive 시스템을 활성화하지 않습니다 실제로 그 느린 스캔을 제안 행동 반응 또는 스캔하는 동안 mechanosensitive 뉴런 (ALM 및 PLM)에서의 칼슘 증가를 관찰하지 않은 (데이터가 표시되지 않음). 상용 LED 시스템을 사용할 수있다. 몇몇 회사는 서로 다른 파장의 LED를 포함 즉시 사용 가능한 솔루션을 제공합니다. LED 외부 TTL 신호와 LED 트리거링 옵션을 가져야한다. 고감도 카메라 동물 이동 칼슘 이미징 필요하다. EMCCD 카메라는 시장에서 가장 민감한 카메라이다. 카메라는 노출시 TTL 출력 (또한 "화재"출력)를 가질 필요가있다. 뚜껑 히터 거꾸로 현미경을 사용하는 경우에는 뚜껑에 응축을 방지 할 필요가있다. 직립 현미경에서 접시가 배치 될 수 있도록 뚜껑 WI하단에하고 것이다 따라서 결로를 방지하고 더 뚜껑 가열이 필요하지 않습니다. 뚜껑 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 접시를 닫고 단단히한다.
PDMS 스탬프
아가 로스를 성형하기위한 구조를 포함 PDMS 스탬프의 표면 거리 PDMS 스탬프를 지원 유리 슬라이드에서 직면된다. 사용자 정의 마이크로 유체 칩을 제공하는 회사와 목록은 위키 백과에 (찾을 수 있습니다 http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies )을.
자신의 방에 선충을 작성
이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계이며, 다음 사항이 고려되어야한다 : A), 아가 로스의 보습이 벌레를 전송 및 이미징에 매우 중요하다. 아가로 오스, 즉, 너무 습하면, 액체 COV가여러 microchambers의 면적 거릴, 그것은 액체 박테리아 멀리 흐르게하므로 제어 된 방식으로 박테리아와 웜 식품을 분배하는 것이 가능하지 않을 것이다. 아가로 오스가 너무 건조하면 다음과 세균과 벌레가 증가 힘이 쉽게 아가로 오스의 손상을 일으키는 벌레와 박테리아를 삭제하는 데 사용 될 필요가 있음을 의미 쉽게 선택을하지 못할 수도 있습니다. 웜을 많이 채울 때 아가로 오스는 건조 할 수있다. 최악의 경우 아가로 오스는 챔버가 붕괴 될 그래서 결국 건조 될 것이다. 아가로 오스가 너무 건조한 경우에는 웜이없는 칩의 측면 상에 작은 방울 S-기저 (약 2 μL)를 배치하여 재수 화 될 수있다. 그런 다음 액체로 선택 백금 와이어를 찍어 심지어 챔버가 벌레로 가득 영역에 액체의 일부를 빼냅니다. B) 음식의 양을 성공적으로 장기 촬상 중요하다. 충분한 음식이없는 경우, 웜은 부족할 수있다. 과도한 음식은 챔버의 캐비티가 있다면액체처럼 오히려 고체처럼 행동하지 않으며 벌레가 박테리아를 밀어 챔버에서 탈출 할 수 있습니다. 전체 챔버를 채우는 세균 현탁액을 획득하는 것을 목표로하고 있습니다. 벌레는 실험 기간 동안 그들의 길이의 대부분을 따라 한천과 유리 표면에 일정한 물리적으로 접촉하고 크롤링 동작은 액체에서 탈곡하는 접시에 운동과 유사과 유사하지 않은 것으로 보인다. 실험을 망칠 수 아가로 오스의 손상 C) 기계. 좋은 선택이 필수적이다. 그것은 날카로운 모서리가 없어야합니다. 피펫 팁에 부착 소프트 속눈썹은 백금 픽업을 사용하는 대신 챔버 내로 박테리아 나 웜을 이동하는데 사용될 수있다. 그러나 대부분의 경우, overdried 아가 손상에 대한 이유이다. 픽업 또는 속눈썹이 이상적 간신히 웜 및 박테리아 해내한다 아가로 오스 상에 자체 및 수막을 터치한다. 챔버를 밀봉 할 때, 다시, 아가 로스의 수분이 필수적이다. 이하지 말아야이 밀봉 동안 세균과 벌레를 씻어 수 있기 때문에 아가로 오스 표면에 어떤 무료 액체를합니다. 큰 기포가 부드럽게 한천 슬래브의 모서리를 해제함으로써 제거 될 수있다. 자주 챔버 안에 갇혀받을 실보다 작은 작은 거품. 이러한 거품은 문제가되지 않습니다 및 흡수에 의해 사라집니다. 접시를 조립 한 후, 아가로 오스가 너무 건조하거나 젖은 것을 다시 확인합니다. 챔버는 잘 밀봉해야하며, 챔버 사이에 액체의 흐름이 안됩니다. 아가 너무 젖은 경우 챔버가 제대로 밀봉되지. 웜 탈출하거나 그들의 음식은 멀리 세척한다. 샘플이 너무 습하면, 간단한 뚜껑을 열고 2 분의 아가로 오스 건조를 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 건조하면 챔버는 붕괴 할 수 있으며, 웜 탈출합니다.
축소에 의해 확장
형광 이미징의 경우, 축소하는 낮은 배율에서 얻어진 빛의 적은 양에 의해 제한된다. 또한, 전자MCCD 카메라는 감도에 최적화 종종 상대적으로 낮은 해상도를 가지고있다. 그러나 영상 4 배 규모를 확대하는 것은 물론 가능하다. 140X (20X 목적 및 0.7X 카메라 마운트를 사용하여 달성) 배율 및 512 X 512 화소, 8 × 8 mm 카메라를 사용할 때 예를 들어, 190 μm의 X 190 μm의 네 챔버는 하나의 프레임에 맞게 할 수있다. (예 : sCMOS 카메라, 16.6 mm X 14mm 칩, 2560 X 2560 픽셀 = 5.5 메가 픽셀)을 큰 칩과 고해상도 카메라는 DIC와 밝은 필드 이미징의 최대 확장 최적화합니다. 100X 배율을 사용하는 경우 예를 들어, 190 μm의 30 L1 벌레까지 X 190 μm의 챔버 (도 3 참조)이 카메라의 각 프레임에 맞게 할 수있다. 원칙적으로, 줌 아웃 및 주사는 동물의 더 큰 수를 획득하기 위해 결합 될 수있다. 하나의 초점 평면 이미지를 만들 필요가 있도록 대부분의 뉴런은 초점이 꽤 잘있어. 뉴런 피에조 드라이브를 사용하여 검사를 AZ, 초점이 이동하는 경우에 발견되는 각각의 시간 (P)에 취해질 수OINT.
다른 동작에 적응
이 프로토콜은 긴 시간 규모에서 행동의 좋은 아이디어를 제공합니다. 물론, 버스트의 타이밍은 다른 동작과 생활 단계에 적응 될 필요가있다.
기술의 한계
여러 가지 요인이 영상의 지속 시간을 제한 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 음식의 양이다. 음식이 소비되면, 유충 개발 중지합니다. 따라서, 작은 실에서 (190 X 190 μm의) 웜은 L3 단계까지 개발 한 후 체포. 이상 촬상 시간이 필요하다면, 더 큰 챔버가 사용될 수있다. 3 일 – 장기 영상의 최대 길이는 2.5의 범위이다. 이상 촬상이 필요한 경우, 웜을 회수하고 새로운 챔버에 배치 될 필요가있다. 성인 벌레를 이미징 할 때, 다른 제한은 이러한 웜의 자손에 의해 발생합니다. 성인 벌레는 유충 부화에서 알을 낳는다. 이 유충은 챔버 내부에 남아있을 것입니다식품을 소비하고, 이미지 분석을 방해 할 수있다. 자손이 문제가 될 경우에는, 멸균 성인 용액을 사용하거나 또는 신선한 챔버로 벌레를 반복적으로 배치하는 것이다. 벌레를 복구하기 위해, 챔버를 포함하는 아가로 슬래브 메스 자유로운 절단은, 커버 슬립을 뽑아되며 웜을 회수 할 수있는 NGM 플레이트 상에 배치된다. 또 다른 한계는 상대적으로 작은 지역에 벌레의 제한 사항입니다. 장거리 이동 분석되어야 할 경우 문제가 될 수있다. 챔버에 동물을 기계적 optogenetically 21,27,34,35 자극 될 수 있으나, 챔버의 밀봉 특성 어려운 가용성 또는 휘발성 자극을 적용 할 것이다. 산소 또는 이산화탄소와 같은 생물학적으로 중요한 가스 한천에서 자유롭게 확산 할 수있다. 접시에 큰 공기 탱크는 실험에 필요한 시간에 걸쳐 일정 챔버의 가스 농도를 유지해야합니다. 그러나, 마음 로컬 산소 concentratio에 보관해야N 실에서 더 많은 접시에 문화보다 액체 문화에서 발견되는 조건과 유사 할 수 있습니다.
기존의 방법에 대한 의미
미세 유체 장치는 크게 C에서 공부 행동 및 발달 고급 엘레. 종종, 미세 유체 구조는 PDMS (12)로 만들어진다. 여기서 우리는 아가로 만든 미세 배양 챔버를 생성하는 프로토콜을 기술한다. 이 기술의 장점은 높은 품질 영상화, 생리적 측정 장기 이미징 및 합리적으로 높은 처리량과 행동의 상관의 조합이다. 고화질 높은 NA를 사용하여 목표 유리 커버 슬립으로 촬상함으로써 달성된다. 그 결과, 칼슘 이미징 및 세포 내 구조물의 촛점 이미징 형광 촬상을 행할 수있다. 동물이 다른 시스템들에서와 같이 고정되지 않기 때문에, 그 생리 학적 측정과 행동의 상관을 허용한다. 벡ause 동물이 충분한 음식을 가지고, 이들은 장기간 촬상있게 계속 개발. 이 시스템은 동물 정의 된 챔버에 하나 실행에 이미지 많은 벌레 제한 할 수 있기 때문이다. 따라서,이 방법은 쉽게 9,27,34-36을 확장 할 수 있습니다.
미래의 응용 프로그램
지금까지,이 시스템은 C. 수면 행동을 연구하기 위해 주로 사용되어왔다 엘레 L1 유충. 그러나, 모든 단계에 대한 적응이 가능 또한 dauers 및 성인에서 행동의 넓은 범위를 공부하게됩니다. 행동의 광범위한는 짝짓기에서 달걀 누워에 이르기까지이 방법으로 공부하실 수 있습니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
막스 플랑크 사회와 HB에 괴팅겐 대학원 주니어 그룹의 봉급은이 작업을 지원.
Materials
| high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
| Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| compound microscope | Nikon | TiE | |
| stereomicroscope | Leica | M5 | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
| lid heater | MPI workshop | custom made | |
| plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
| z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
| red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
| double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |
Referencias
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