JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: June 24, 2015
doi:
10.3791/52742
, ,
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Summary

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Abstract

Davranış sinir sistemi tarafından kontrol edilir. Kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis çeşitli davranışları sırasında nöron aktivitesinin ölçülmesi için elegans şeffaf bir nematod basit bir yöntemdir. Davranışı ile sinir aktivitesi ilişkilendirmek için, hayvan immobilize olmamalı taşımak gerekir. Birçok davranış değişiklikleri, uzun zaman ölçeklerinde sırasında meydana ve davranış birçok saat boyunca kayıt gerektirir. Bu aynı zamanda, kültür gerekli gıda mevcudiyetinde solucanlar yapar. Nasıl solucanlar kültüre ve sinirsel aktivite uzun zaman ölçeklerinde üzerinden görüntülü olabilir? Agaroz Microchamber Görüntüleme (AMI) daha önce kültür geliştirilmiştir ve küçük larvaları gözlemlemek ve şimdi C. yetişkin aşamasına kadar erken L1 tüm yaşam evrelerini incelemek için adapte edilmiştir edildi elegans. AMI C. çeşitli yaşam evrelerinde yapılabilir elegans. Uzun vadeli kalsiyum görüntüleme com kısa dışarıdan tetiklenen pozlama kullanarak hayvanları hareketsiz olmadan elde edilirşarj çiftli cihaz (EMCCD) kamera kaydını çarparak bir elektron ile kombine. Uzaklaştırma veya tarama paralel 40 solucanlar kadar görüntü bu yöntemi kadar ölçeklendirilebilir. Böylece, bir yöntem C. tüm yaşam evrelerinde uzun zaman ölçeklerinde üzerinde görüntü davranış ve sinirsel aktivite açıklanan elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.

Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.

When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.

Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

Protocol

1. Göstergeler, Kültür Medya ve Yemekleri Odak numune tutma kapasitesine sahip olan ve bir otomatik aşama ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Bir ısmarlama kapak ısıtıcı kurmak veya ticari bir çözüm satın alın. Kameranın poz üreticinin talimatlarına kullanarak TTL sinyali ile LED aydınlatma tetikler hangi bir LED-EMCCD kamera sistemi kurun. Not: Ayrıntılar için tartışma bakın. Polydimethylsiloxan (PDMS) pulları: Bir Mikroakiskan tesisinde PDMS pulları Üretiyor ya da ticari bir dökümhane tarafından üretilen PDMS pul var. Ticari bir dökümhane kullanmak için, cihazın (örneğin 15 um) derinliği şirkete AutoCAD dosya göndermek ve belirtin. Dökümhaneden Doğumdan sonra, bir neşter kullanarak 16 pulları içine PDMS çip kesti. Hava plazma kullanarak bir bardak slayt her damga Bond. Yapıştırma için, PDMS damga ve hava plazmaya cam slayt hem maruznöbeti 1 dakika (0.5 mbar, en yüksek plazma ayarlarını kullanarak). Yapıştırılması için yüzeyleri plazma tedavisi sırasında yukarı doğru baktığından emin olun. Ardından, cam slayt üzerine PDMS damga yerleştirin. 3,5 cm alt çanak alın ve dikey freze makinesi ve keskin döner kesiciler kullanarak çanak alt merkezine 18 x 18 mm kare alana kesip. Sürtünme tarafından üretilen ısı nedeniyle erimesi ile ilgili plastik önlemek için kesici ve yavaş besleme düşük dönme hızı kullanın. Aynı anda birkaç yemekler hazırlayın. Not: Alt çanak deney sonrasında birçok kez tekrar kullanılabilir saf etanol O / N ıslatıldıktan sonra temizlenir eğer. Agaroz: 100 ml 3 g, yüksek erime noktalı agaroz eritilir S-Bazal (5.85 g NaCI, 1 g K 2 HPO 4, 6 gr KH 2 PO 4 etanol, 1 mi kolesterol (5 mg / ml), H2 O, 1 L, kaynatarak) otoklavlanarak sterilize edin. 2 ml Eppendorf tüpleri ve stor agaroz eritilir hacimde yapmake. Ayrıca, yüksek erime noktalı agaroz ile tam olarak aynı şekilde, düşük erime noktalı agaroz toplu hazırlar. 98 ° C – kullanmayın agaroz 95 bir ısıtma bloğu üzerine yüksek erime noktası 3 bölüntülerin yerleştirmek için önce. 35 ° C – 30 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerine daha sonra eritilip kadar 98 ° C – 95 ile agaroz bir ısıtma bloğu üzerinde, kullanımı, düşük erime noktasına sahip olan bir kısım yer önce. Hayvanların 2. Seçimi Temiz hayvanları elde etmek için seribaşı NGM plakalar üzerinde düşük yoğunlukta solucanlar büyütün. Gıda ve sadece birkaç hayvanların bol plaka üzerinde olduğundan emin olun. Görüntüleme L1 larvaları için, taze bir numaralı seribaşı NGM plaka üzerine simit aşamasında embriyoları içeren yaklaşık 30 yumurta transferi. Daha sonra larva aşamalarını veya yetişkin C aktarmak için elegans, taze numaralı seribaşı NGM plaka üzerine yaklaşık 30 solucanlar aktarın. Agaroz microchambers 3. hazırlanması Yemeğin hazırlanması: Altındaki 18 x 18 mm kare bir açıklığı olan bir plastik tabak almak ve ters yukarı bakacak şekilde açılması ile yerleştirin. Deliğin üzerine 20 x 20 mm çift taraflı yapışkan bant parçası koyarak ağzını kapatınız. Yapışkan bant altta olacak şekilde çanak Arkanı dön ve sert bir yüzeye çanak yerleştirin. Ücretsiz neşter kullanılarak açılış kesin. P1000 pipet kullanarak, çanak içine S-bazal içinde% 3 yüksek erime noktalı agaroz 2 ml doldurun. Açılış çevreleyen alan üzerine agaroz yerleştirin ve katılaşmaya edelim. Agaroz katı kadar bekleyin. Çanak Arkanı dön ve yapışkan garnitür kalır ve maruz kalacağı ve böylece çift taraflı yapışkan bant kaplayan koruyucu filmi soyulabilir. Not: Sonuç olarak, yapışkan bant ince bir halka açma dışında saracaktır. Agaroz sonra numuneyi çevreleyen bir nem deposu olarak hizmet vermektedir. Microchambers dökümü: Th Açığa60 saniye – 20 hava plazma ile kalıplama e PDMS yüzeyi. Not: Bu plazma tedavisi hava kabarcıkları yakalama engeller ve daha keskin baskılar üretir, PDMS hidrofil yüzey oluşturur. 9 cam slaytlar – 5 istifleme eşit yükseklikte iki ayırıcılar oluşturun. Yeri, uzun tarafı, ilk aralama yığını daha sonra tek bir cam slayt, sonra tekrar bir boşluk yığınına paralel olarak. Aralama karşısında dik PDMS damga içeren cam slayt yerleştirin. PDMS damga kalıp yüzeyi ve tek cam slayt arasında yaklaşık 1.5 mm'lik bir boşluk var ki aralama yüksekliğini ayarlayın. PDMS sıvı agaroz içine dikey olarak damga slayt hızla PDMS damga yakın tek cam slayt üzerine sıcak sıvı yüksek erime noktası agaroz bir damla koyun ve. Agaroz katılaşmaya edelim. Genellikle yaklaşık 2 dakika sürer opak bir görünüm, alır emin olun. Tek hareket ile dikey damgasını çekin. Not: gl için uygundurue bırakıcı çift taraflı yapışkan bant ile birlikte slaytlar. damganın dikey hareketi agaroz sıkışıp gelen hava kabarcıkları önler. Ince bir platin tel çekme kullanarak agaroz üzerine OP50 bakteri ile birlikte yumurta veya solucanlar aktarın. Bir kirpik kullanan gıda ile birlikte bir yumurta ya da odasının başına bir solucan dağıtın. Tek agaroz ped üzerine yaklaşık 30 yumurta doldurun. Bu yemeğin ağzına güzel uyuyor ki yaklaşık 15 x 15 mm kare içine doldurulan microchambers içeren agaroz levha kesti. Forseps ile kare agaroz levha Pick up ve 20 x 20 mm cam lamel üzerine baş aşağı yerleştirin. Bir kez düştü, tekrar yukarı kaldırın veya bu bakteri ve solucanlar kendi odalarının dışına itti neden olabilir, çünkü etrafta kaydırın yok. Yemeğin Meclisi: Plastik tabak açılması üzerine cam lamel yerleştirin. Yavaşça çift taraflı yapışkan bant yapılmış halkası üzerine cam lamel bastırın.Camı kırmak için özen gösterin. Baş aşağı çevirin ve çanak yaklaşık 30 ° C'ye kadar soğutulur microchambers içeren agar levha ve sıvı düşük erime noktası agaroz ile agaroz rezervuar arasındaki boşluğu doldurmak için P1000 pipet kullanın. Agaroz katılaşmış kadar bekleyin. Bir kapak ile çanak mühür. Ters mikroskoplar için ısıtmalı kapak kullanın. Dik mikroskoplar için normal bir kapak kullanımı ve Parafilm çanak mühür. Microchambers hazırlanmasını bitirdikten sonra, bir stereo mikroskop altında onları kontrol edin. Doğru dolgu çok önemlidir. Ayrıntılar için tartışma bakın. 4. Kalsiyum Görüntüleme Böyle HBR16 27 ([PNÖH'ün-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)] goeIs5) olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri ifade transgenik suşları kullanın. Geniş alan Epifloresans için donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın. Için EMCCD kameranın TTL çıkışını bağlayınKamera örneği yanar bir çerçeve kaydeder her zaman böylece LED TTL girişi. Yaklaşık 5 msn bir pozlama süresi kullanın. 50-300 aralığında EM kazanç kullanın. Her 15 görüntülü her solucanı 24 saat bir patlama film çalışan belirtin – daha sonra ilk 30 dakika DIC ile 20 saniye boyunca, GCaMP kaydetmek ve sonra mKate2 sinyalinin son görüntüyü çekmek için bir GFP floresan ile 20 sn alınır sentezleme seviyeleri için kontrolü. Her patlama sırasında 2 / sn kare hızı kullanın. Görsel veri denetimi için, floresan küçük değişiklikler görünürlüğünü artırmak için yanlış renk haritası kullanın. F floresan ortalama başlangıç ​​değeri olan ile mesafe kadar taşınmış / F olarak arsa floresan veri. Kalsiyum veri analizi ayrıntılı bir açıklaması literatüründe 20 bulunabilir. Çoklu Worms 5. Paralel AMI , Mikroskop üzerine microchambers içeren çanak yerleştirin örnek üzerinde odaklanmak ve autofo meşgulcus. Kamera solucan başına 1.920 kare, verilerin makul bir miktarın neden olacaktır 24 saat, 20 saniye içinde her yarım saatte 40 resim karelerinin bir patlama kazanır, böylece bir yazılım protokolünü ayarlayın. Bu sahne kullanarak her solucanı ziyaret böylece tarama ayarlayın. Tek vadede yaklaşık 30 solucanlar film hedefleyin. Daha düşük büyütme kullanılarak, yani uzaklaştırma Image birden solucanlar. Kamera çip ile birkaç microchambers kapsayacak ve aynı anda birden fazla bitişik microchambers film düşük büyütme kullanın. Görüntü elde etme sonunda, bir hayvan kapsayan bir ilgi bölge kırpma yoluyla her odası için verileri ayırın. Hızlı hareketlilik verilerini değerlendirmek için, çerçeve çıkarma 28-32 kullanın. C. 6. Görüntüleme Farklı Yaşam Evreleri elegans C. tüm yaşam evrelerinde agaroz microchambers kullanın elegans L1 yetişkin ve dahil dauers için. Dif için uygun odacık boyutlarını kullanınTablo 1 'de gösterilmiştir ferent ömrü aşamaları. Hayat aşaması Oda boyutu Kamara derinliği Normal kayıt süresi Büyütme L1 190 x 190 mm 10-15 um Yumurta – orta L2 400X L2 370 x 370 mm 15 um Yumurta – L3 200X Dauer larva 370 x 370 mm 25 mikron 4 gün 200X L3 700 x 700 mm 45 mikron L2 – L4 200X L4 700 x 700 mm 45 mikron Genç L4 – genç erişkin 100X Genç erişkin 700 x 700 mm 45 mikron </td> 12-24 saat 100X Farklı yaşam evrelerinde Tablo 1. Odası boyutları. Gösterildi vardır 8 x 8 mm kamera çipi için optimize çeşitli aşamalarında için yararlıdır odası boyutları ve büyütme.

Representative Results

Agaroz microchambers C arasında herhangi bir yaşam aşamasında uygulanabilir elegans. Şekil 1A'da görüldüğü gibi, L1 lethargus sırasında larva gelişimi ve uyku davranışı görülmektedir. Derin 190 x 190 mm, 10 mm olan bölme boyutları Gösterildi. Daha uzun bir zaman ölçekleri gerekliyse, daha büyük odaları kullanılabilir. Daha büyük boyutlu (370 x 370 um, 25 um derinliğinde) olan bir odacığı kullanılarak, Şekil 1B'de görüldüğü gibi C geliştirilmesini sağlar elegans yumurtadan yetişkin kadar. Şekil 1C yetişkin kadar yumurtadan bir odasında yetişen bir solucanın çerçeve çıkarma kullanarak davranışı uzun vadeli değişikliklerin analizini göstermektedir. Sonrasında ve lethargus sırasında seçilen patlamaları için çerçeve çıkarma sonrası ortalama şiddetleri gösterilir vardır. solucanın hareketlilik alt çerçeve çıkarma değerleri sonrası ortalama yoğunluğudur düşük. Gösterilen bir uyandırma durumu ve larva dönemi başına bir lethargus durumundan patlama izleri seçilir.gelişimi sırasında ortalama yoğunluk gözlenen artış hayvanın artan kontrast ve büyüklüğü çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Şekil 1D bir Dauer larva, olumsuz çevre koşulları 33 sırasında devreye girer alternatif yaşam aşamasını gösterir. Oda boyutu 370 x 370 mm, 15 mm derin. Dauer larva aşamasından çıkmak neden olur ki, Dauer larva bakteriyel gıda olmadan odasına konuldu unutmayın. Şekil 1E zaten odasına birçok yumurta atmıştır yetişkin bir solucan göstermektedir. Yetişkin için kullanılan Kazan boyutları derin 700 x 700 mm, 45 mm idi. Son olarak, Şekil 1F yetişkin hermafrodit ve yetişkin bir bölme içinde bir erkek çiftleşme göstermektedir. Hareketli solucanlar Kalsiyum görüntüleme. GCaMP kalsiyum sensörleri ile mümkündür 2A, L1 larva 27 komut interneuron AVA B gösterisi kalsiyum görüntüleme Rakamlar. 2C sa kalsiyum faaliyet gösterecek D, RakamlarBir yetişkin hayvan nöron beni türü. Uzun vadeli görüntüleme ölçeklendirme tarayarak ve uzaklaştırma ile mümkündür. 3A, 5 megapiksel kamera ile tek kamera çip 30 solucanlar eşzamanlı görüntüleme görüntü kalitesini gösterir. Şekil 3B aynı anda görüntülü 4 solucanlar kalsiyum görüntü kalitesini göstermektedir. C. tüm yaşam evrelerine AMI 1. Adaptasyon Şekil 190 x 190 mm ​​odalarına erken L2 aşamasına kadar erken L1 görüntülü elegans. (A) Larva. 370 x 370 mm odasında yetişkin kadar yumurtadan (B) geliştirilmesi. Bir solucanın (C) Hareketlilik çerçeve çıkarma kullanılarak değerlendirildi. Her larva sta için bir seçili patlama film için çerçeve çıkarma sonra görüntünün tüm resimlerin ortalama yoğunluğu Gösterildisonrasında ve lethargus davranış ge. 370 x 370 um odası içinde gıda olmadan (D) bir Dauer larva. 700 x 700 mikron odasına koydu birçok yumurta (E) Yetişkin hermafrodit. (F) bir erkeğin Çiftleşme ve 700 x 700 mikron odasının içine bir hermafrodit. YA genç yetişkin anlamına gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. AMI Şekil 2. Kalsiyum görüntüleme. AVA nmr-1 promotör kullanarak L1 larvaların komuta interneuron içinde GCaMP3 ile (A) Kalsiyum görüntüleme. İki yanlış renkli görüntüler gösterilir vardır. Sol resimde, AVA aktivitesi düşüktür ve solucan bir geriye hareketi yapmıyor. Sağ resimde AVA aktivitesidir yüksek ve solucan geriye hareket ediyor. L1 solucanı için zamanla (B) Kalsiyum geçici. (C, D) yetişkin hayvan Kalsiyum transientler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Yakınlaştırıp uzaklaştırarak paralel Şekil 3. Görüntüleme birden solucanlar. (A) Eşzamanlı 190 x 190 mikron odaları kullanarak kare başına 30 L1 solucanlar görüntüleme ve 100X büyütme (10X objektif kullanılarak) ve 16,6 x 14 mm kamera çipi. (B) 370 x 370 mm odaları ve 100X büyütme ve 16,6 x 14 mm kamera çip ilgi bir bölge kullanarak çerçeve başına dört L3 solucanlar Simultane görüntüleme.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Donanım

Bir mikroskop odak noktası genellikle uzun süreli görüntü alımı sırasında sürüklenir. Bileşik Mikroskop, odak tutma sistemleri önemli mikroskop üreticilerden satın alınabilir. Odak kontrolü ile bir bileşik mikroskop çok pahalı durumda, basit bir alternatif Stereomikroskopta kullanmak olacaktır. Bileşik mikroskoplar yüksek sayısal açıklık (NA) ile hedeflerin kullanımına izin ve kolayca otomatik hale getirilebilir. 40X petrol hedefleri uygundur. Suya daldırma lensler nedeniyle uzun süreli görüntüleme sırasında buharlaşma ideal değildir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) morfolojik ve davranışsal değişiklikleri takip için yardımcı hoş bir kontrast oluşturur, ama basit parlak alan görüntüleme de kullanılabilir. DIC veya parlak bir alan görüntüleme için, mikroskop dia-aydınlatma yoluna bir kırmızı ışık filtresi koyarak kırmızı ışık kullanın. Birkaç microchambers taranması için otomatik sahne gereklidir. En iyi performans acbir sahne doğrusal olmayan hızlanma ve yavaşlama vardır ve tarama sırasında hayvanların rahatsız engellemek için düşük tarama hızı ayarlanabilir olduğu kullanıldığında hieved. Biz solucanın mechanosensitive sistemini aktive değil aslında o yavaş tarama düşündüren davranışsal tepkiler ya da tarama sırasında mechanosensitive nöronların (ALM ve PLM) kalsiyum artışı gözlenen değil (veriler gösterilmemiştir). Ticari LED sistemler kullanılabilir. Birçok şirket, farklı dalga boylarında LED'ler dahil hazır kullanımlı çözümleri sunuyoruz. LED dışarıdan bir TTL sinyali ile LED tetikleme seçeneği olmalıdır. Bir çok duyarlı kamera hayvanlar hareketli kalsiyum görüntüleme için gereklidir. EMCCD kameraları piyasadaki en hassas kameralar. Kamera pozlama sırasında bir TTL çıkışı (aynı zamanda sözde "ateş" çıkışı) olması gerekir. Bir kapak ısıtıcı, bir ters mikroskop kullanılarak, eğer kapak üzerinde yoğunlaşmasını önlemek için gereklidir. Dik bir mikroskop, çanak alınacaktır böylece kapak wialtta olacak ve ll böylece yoğuşma önlenir ve hiçbir kapak ısıtma gereklidir. kapak uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için çanak yakın sıkıca gerekir.

PDMS pulları

agaroz kalıplama için yapısını içeren PDMS damga yüzeyi uzak PDMS damga destekleyen cam slayt, gelen karşı karşıya. Özel mikroakışkan cips sunan şirketlerle bir liste Wikipedia'da (bulunabilir http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Onların odalarına nematodların Dolum

Bu protokolde en kritik adımdır ve aşağıdaki noktalar dikkate alınmalıdır: A) agaroz nemlilik solucanlar aktarmak için ve görüntüleme için çok önemlidir. Agaroz, yani çok nemli ise, bir sıvı cov varBirkaç microchambers bir alanı ering, sıvı bakteri akıp yapacak çünkü kontrollü bir şekilde bakteriyel gıda ve solucanlar dağıtılması mümkün olmayacaktır. Agaroz çok kuru ise, bakteri ve solucanlar artan kuvvet kolayca agaroz zarar verir solucanlar ve bakteri damla kullanılması ihtiyacı var demektir kolayca seçim kurtulmak olmayabilir. Solucanlar bir sürü doldururken agaroz kadar kuru olabilir. En kötü durumda agaroz odaları çökecek sonunda çok kuru olacak. Agaroz çok kuru ise hiçbir solucanlar vardır çip yüzüne küçük bir damla S-Bazal (yaklaşık 2 ul) koyarak rehidre edilebilir. Sonra sıvı içine almak platin tel daldırma ve hatta odaları solucanlar ile doldurulur alana sıvı bazı çekin. B) Gıda miktarı uzun vadede başarılı görüntüleme için kritik önem taşımaktadır. Yeterli yiyecek yoksa, solucanlar dışarı çalıştırabilir. Aşırı gıda bölmesi boşluğu varsabir sıvı gibi değil, bir katı gibi davranmaz ve solucanlar bakterileri iterek odasına kaçmak için izin verecektir. Tüm odasını dolduran bir bakteri süspansiyonu elde etmek hedefliyoruz. solucanlar deney sırasında kendi uzunluğunun büyük bir kısmı boyunca agar ve cam yüzeyi ile fiziksel olarak sürekli temas halindedir ve tarama davranışı sıvıda dayak bir plaka üzerinde hareket benzer ve farklı gibi görünmektedir. Denemeyi berbat edebilir agaroz zararlı C) Mekanik. İnce seçim esastır. Bu keskin köşeleri olmamalıdır. Bir pipet ucuna bağlı bir seçenek kirpik platin çekme kullanmak yerine bölmelerine bakteri veya solucan hareket ettirmek için kullanılabilir. Çoğu durumda, bununla birlikte, fazla kurutulmuş agaroz hasarı nedeni budur. seçim veya kirpik, ideal olarak, sadece zar zor solucanlar ve bakterileri çekip gereken agaroz yüzeyinde agaroz kendisi ve su filmi temas etmelidir. Odaları sızdırmazlık zaman, yine, agaroz nem gereklidir. Orada olmamalıBu mühürleme sırasında bakteri ve solucanlar yıkayacak çünkü agaroz yüzey üzerinde herhangi bir serbest sıvı olabilir. Büyük kabarcıklar yavaşça agar kütüğün bir köşe kaldırarak uzaklaştırılabilir. Genellikle odaların içinde sıkışıp olsun odasının daha küçüktür Küçük kabarcıklar. Bu kabarcıklar bir sorun değildir ve emilim yoluyla kaybolur. Çanak montaj sonra, agaroz çok kuru ya da çok ıslak olmadığını tekrar kontrol edin. odaları güzel mühürlü olmalı ve odacıklar arasında herhangi bir sıvı akışı olmamalıdır. Agaroz çok ıslak ise, odaları düzgün mühür olmaz. Solucanlar kaçabilir ya da yiyecek arınacak. Numune çok nemli ise, basit kapağı açın ve bir iki dakika için agaroz kurumaya bırakın. Agaroz çok kuruysa, odalar çökebilir ve solucanlar kaçacaktır.

Uzaklaştırma tarafından ölçeklendirme

Floresan görüntüleme için, uzaklaştırma, düşük büyütmede elde edilen ışığın düşük miktarı ile sınırlıdır. Ayrıca, EMCCD kameralar duyarlılık için optimize edilmiş ve genellikle nispeten düşük çözünürlüğe sahiptir. Ancak, görüntüleme dört kat yukarı ölçeklendirme de mümkündür. 140x (20X Amaç ve 0.7X kamera montaj kullanılarak elde) büyütme ve 512 x 512 piksel, 8 x 8 mm kamerayı kullanırken Örneğin, 190 um x 190 um dört odaları tek bir kare üzerine sığabilecek. (Örneğin sCMOS kameralar, 16.6 mm x 14 mm yonga, 2560 x 2560 piksel = 5,5 Megapiksel gibi) büyük bir çip ile yüksek çözünürlüklü kamera DIC ve parlak saha görüntüleme ölçeklendirme optimize. Bir 100x büyütme kullanırken Örneğin, 190 mikron 30 L1 solucanlar kadar x 190 mikron odaları (bakınız Şekil 3) Bu kameranın her kare üzerine sığabilecek. Prensip olarak, uzaklaştırma ve tarama da hayvanların daha büyük sayıda elde etmek için kombine edilebilir. Sadece bir odak düzlemi görüntülü gerektiğini, böylece çoğu nöronlar, odakta oldukça iyi muaftır. Nöronlar piezo sürücüsü kullanarak taramayı AZ, odak dışına taşımak için tespit edilirse her zaman p alınabiliroint.

Farklı davranışları Uyum

Bu protokol uzun zaman ölçeklerinde karşısında davranış iyi bir fikir verir. Açıktır ki, patlamaların zamanlaması farklı davranış ve yaşam evrelerinde adapte edilmesi gerekmektedir.

Tekniğin Sınırlamalar

Çeşitli faktörler görüntüleme süresini sınırlamak. En önemli gıda miktarıdır. Gıda tüketilen sonra, larvalar gelişmekte durdurmak. Böylece, küçük odacıklarda (190 x 190 mm) solucanlar L3 aşamasına kadar gelişebilir ve ardından tutuklama. Uzun görüntüleme zamanı gerekli ise, daha büyük bölümler kullanılması gerekir. 3 gün – Uzun süreli görüntüleme maksimum süresi 2.5 aralığındadır. Uzun görüntüleme gerekli ise, solucanlar geri kazanılır ve yeni odalarına yerleştirilmesi gerekir. Erişkin solucanlar görüntüleme yaparken, başka bir sınırlama bu solucanların yavru kaynaklanır. Yetişkin solucanlar hangi larva yumurtadan yumurta yatıyordu. Bu larvalar da odasının içine kalacak, Gıda tüketmek ve görüntü analizi rahatsız edebilir. Yavrular bir sorun varsa, çözüm steril yetişkin kullanmak ya da taze odalarına solucanlar defalarca yerleştirmektir. Solucanlar kurtarmak için, odacık içeren agaroz kütük bir bisturi ile kesilip olup, lamel çekilir ve solucanlar elde edilebilir olan bir NGM plaka üzerine yerleştirilir. Başka bir sınır nispeten küçük alanlara solucanlar kısıtlamadır. Uzun menzilli hareketi analiz edilmesi gerekir, bu bir sorun olabilir. Odalarına hayvanlar mekanik ve optogenetically 21,27,34,35 stimüle edilebilir olsa da, odanın mühürlü doğası zor çözünür veya uçucu uyarıcılar uygulamak için yapacaktır. Bu oksijen veya karbon dioksit gibi Biyolojik olarak önemli gazlar agar serbestçe yayılabilir. çanak büyük hava deposu deneyleri için gerekli zaman içinde sabit odalarına gaz konsantrasyonlarını tutmalı. Ancak, zihin yerel oksijen konsantrasyon içinde tutulmalıdırn odasında daha plaka üzerinde kültürden daha sıvı kültüründe bulunan koşulları benzeyebilir.

Mevcut yöntemlere göre önemi

Mikroakışkan cihazlar büyük ölçüde C okudu davranışsal ve gelişimsel gelişmiş elegans. Çoğu zaman, mikro-akışkan yapı PDMS 12 yapılmıştır. Burada agaroz yapılan mikroakışkan kültür odaları oluşturmak için bir protokol açıklar. Bu tekniğin mukavemetli, yüksek görüntü kalitesi, fizyolojik ölçümler, uzun vadeli bir görüntüleme ve oldukça yüksek bir verimlilik ile davranış korelasyon birleşimidir. Yüksek görüntü kalitesi yüksek NA hedeflerini kullanarak cam lamel sayesinde görüntüleme elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, örneğin kalsiyum görüntüleme ve hücre içi yapıların konfokal görüntüleme gibi floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Hayvanlar, diğer sistemlerde olduğu gibi hareketsiz olmadığından, fizyolojik ölçümler davranış bir korelasyon verir. Because hayvanlar bol gıda var, onlar uzun vadeli görüntüleme izin gelişmekte devam. Bu sistem hayvanların belirlenen odalarına bir vadede görüntü pek çok solucan kısıtlanır çünkü. Böylece, bu yöntem kolayca 9,27,34-36 kadar ölçeklendirilebilir.

Gelecekteki uygulamalar

Şimdiye kadar, bu sistem, C uyku davranışı incelemek için ağırlıklı olarak kullanılmaktadır elegans L1 larvaları. Bununla birlikte, tüm aşamalarında uyum mümkün da dauers ve yetişkinlerde davranışlarının geniş bir çalışma için yapacaktır. Davranışları geniş bir dizi çiftleşme gelen yumurtlama kadar bu teknikle ele alınabilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Max Planck Kurumu ve HB için Göttingen Enstitüsü Genç Grubu stipend bu işi finanse.

Materials

high-melting point agarose Fisher Bioreagents BP(E)164-1000
Top Vision Low Melting Point Agarose Thermo Scientific R0801
LED system CoolLED pE-2
compound microscope Nikon TiE
stereomicroscope Leica M5
EMCCD camera Andor iXon 897 now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera Andor Neo
plasma cleaner Harrick PDC-23G2
lid heater MPI workshop custom made
plastic dish Falcon 08-757-100A
z-stage for the microscope Prior Nano Scan Z
x-y-stage for the microscope Prior Proscan III
PDMS stamp Abbott Laboratories  custom made
red light filter Chroma ET660/50m
35mm petri dish Falcon Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning
double sided sticky tape Sellotape/Henkel double sided 12mm x 33 m alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208 (2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O’Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198 (2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782 (2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Biología del desarrollo. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853 (2013).

Tags

Calcium ImagingCaenorhabditis ElegansAgarose MicrochambersLong-termComportamientoNeural ActivityEMCCDParallel Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Turek, M., Besseling, J., Bringmann, H. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (100), e52742, doi:10.3791/52742 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image