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Neurociencias

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: June 24, 2015
doi:
10.3791/52742
, ,
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Summary

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Abstract

El comportamiento es controlado por el sistema nervioso. El calcio de imágenes es un método directo en el nematodo Caenorhabditis elegans transparente para medir la actividad de las neuronas durante varios comportamientos. Para correlacionar la actividad neural con el comportamiento, el animal no debe ser inmovilizado, pero debe ser capaz de moverse. Muchos cambios de comportamiento ocurren durante escalas de tiempo largos y requieren grabar durante muchas horas de comportamiento. Esto también hace que sea necesario para la cultura de los gusanos en la presencia de alimentos. ¿Cómo pueden los gusanos cultivarse y su actividad neuronal fotografiado en escalas de tiempo largas? Agarosa Microcámara Imaging (IAM) fue desarrollado previamente a la cultura y observar pequeñas larvas y ahora se ha adaptado para estudiar todas las etapas de la vida desde la primera L1 hasta la etapa adulta de C. elegans. AMI se puede realizar en varias etapas de la vida de C. elegans. Imágenes de calcio a largo plazo se logra sin inmovilizar a los animales mediante el uso de las exposiciones a corto provocados externamente comcombinado con un electrón multiplicando la grabación del dispositivo (EMCCD) cámara de carga acoplada. Alejar o exploración puede ampliar este método a la imagen hasta 40 gusanos en paralelo. Por lo tanto, se describe un método para el comportamiento y la actividad neural imagen en escalas de tiempo largas en todas las etapas de vida de C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.

Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.

When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.

Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

Protocol

1. Los instrumentos, medios de cultivo, y platos Utilice un microscopio que es capaz de mantener la muestra en el foco y que está equipado con una etapa automática. Construir un calentador tapa a medida o comprar una solución comercial. Configurar una-EMCCD LED sistema de cámara en la que la exposición de la cámara desencadena LED de iluminación a través de una señal TTL utilizando las instrucciones del fabricante. Nota: Ver Discusión para más detalles. Polydimethylsiloxan (PDMS) sellos: Fabrique PDMS sellos en un centro de microfluidos o tiene los sellos de PDMS producido por una fundición comercial. Para utilizar una fundición comercial, enviar un archivo de autocad a la empresa y especificar la profundidad (15 micras, por ejemplo) del dispositivo. Después de la entrega de la fundición, cortar el chip PDMS en sus 16 sellos utilizando un bisturí. Bond cada sello individual a un portaobjetos de vidrio utilizando plasma de aire. Para la unión, exponer tanto el sello de PDMS y el portaobjetos de vidrio con el plasma de aire para unpelea de 1 min (utilizando la configuración de plasma más altos en el 0,5 mbar). Asegúrese de que las superficies de unión frente al alza durante el tratamiento de plasma. Luego, coloque el sello PDMS sobre el portaobjetos de vidrio. Tome una 3,5 cm plato inferior y cortar un área cuadrada de 18 x 18 mm desde el centro de la parte inferior de la cápsula, utilizando una máquina de fresado vertical y cortadores rotativos afilados. Utilice baja velocidad de rotación del cortador y la alimentación lenta para evitar que el plástico de la fusión debido al calor producido por la fricción. Prepare varios platos a la vez. Nota: El plato de fondo puede ser reutilizado muchas veces después del experimento si se limpia después de la inmersión en etanol puro O / N. Agarosa: Disolver 3 g de alto punto de fusión de agarosa en 100 ml S-basal (5,85 g de NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol), H 2 O a 1 L, esterilizar en autoclave) por ebullición. Hacer alícuotas de la agarosa disuelta en 2 ml tubos Eppendorf y store. Además, preparar un lote de agarosa de bajo punto de fusión exactamente de la misma manera como el punto de agarosa alto punto de fusión. Antes de su uso, coloque 3 alícuotas de alto punto de fusión de agarosa en un bloque de calentamiento a 95-98 ° C. Antes de su uso, coloque una alícuota de bajo punto de fusión de agarosa en un bloque de calentamiento a 95-98 ° C hasta que se haya derretido y luego en un bloque de calentamiento a 30 – 35 ° C. 2. Selección de los Animales Crecer gusanos a una densidad baja en placas NGM semilla para obtener animales limpios. Asegúrese de que hay un montón de comida y sólo unos pocos animales en el plato. Para imágenes larvas L1, la transferencia de unos 30 huevos que contienen embriones en la etapa de pretzel en una placa de NGM sembrado fresco. Para la transferencia de fases larvarias tarde o adultos C. elegans, traslado de unos 30 gusanos en una placa de NGM sembrado fresco. 3. Preparación de agarosa microcámaras Preparación de la cápsula: Tome un plato de plástico con una abertura cuadrada de 18 x 18 mm en la parte inferior y colocarlo boca abajo con la abertura hacia arriba. Cierre la apertura mediante la colocación de una pieza de doble cara cinta adhesiva de 20 x 20 mm en la abertura. Girar el plato alrededor de modo que la cinta adhesiva está en la parte inferior y colocar el plato sobre una superficie dura. Corte la abertura gratis con un bisturí. Con una pipeta P1000, llenar 2 ml de 3% de agarosa de alta fusión en S-basal en el plato. Coloque la agarosa en el área que rodea la abertura y dejar que solidifique. Espere hasta que la agarosa es sólido. Date la vuelta el plato y se desprenda la película protectora que cubre la cinta adhesiva de doble cara para que el lado adhesivo permanecerá en el plato y será expuesto. Nota: Como resultado de ello, un fino anillo de cinta adhesiva rodeará la parte exterior de la abertura. La agarosa sirve como un depósito de humedad que luego rodear la muestra. Casting de microcámaras: Exponga ªsuperficie PDMS correo para moldear con plasma de aire de 20 a 60 seg. Nota: Este tratamiento de plasma hace que los PDMS superficie hidrófila, lo que impide el atrapamiento de burbujas de aire y produce impresiones más nítidas. Construir dos espaciadores de igual altura apilando 5-9 portaobjetos de vidrio. Place, en paralelo a sus lados largos, la primera pila espaciador, a continuación, un único portaobjetos de vidrio, y luego de nuevo una pila espaciador. Colocar el portaobjetos de vidrio que contiene el sello PDMS ortogonalmente a través de los espaciadores. Ajustar la altura de los espaciadores de modo que hay un espacio de aproximadamente 1,5 mm entre la superficie de moldeo del sello PDMS y el portaobjetos de vidrio individual. Coloque una gota de líquido caliente de agarosa de alto punto de fusión en el portaobjetos de vidrio sola cerca del sello de PDMS y rápidamente se deslizan los PDMS sello verticalmente en la agarosa líquida. Deje que la agarosa solidifique. Compruebe que se pone una apariencia opaca, que por lo general toma alrededor de 2 min. Retire el sello verticalmente con un movimiento. Nota: Es conveniente glue el separador se desliza junto con cinta adhesiva de doble cara. El movimiento vertical del sello evita que burbujas de aire de quedar atrapado en la agarosa. La transferencia de los huevos o gusanos junto con bacterias OP50 en la agarosa usando un pico fino alambre de platino. Distribuir un huevo o un gusano por cámara junto con alimentos utilizando una pestaña. Rellene alrededor de 30 huevos en una sola plataforma de agarosa. Cortar la losa de agarosa que contiene las microcámaras llenos en un cuadrado de aproximadamente 15 x 15 mm de modo que encaja muy bien en la apertura del plato. Recoge la losa de agarosa plaza con unas pinzas y colóquela boca abajo sobre un cubreobjetos de vidrio de 20 x 20 mm. Una vez caído, no levante de nuevo o deslice alrededor porque esto puede causar que las bacterias y gusanos para ser empujado fuera de sus cámaras. Asamblea del plato: Coloque el cubreobjetos de vidrio sobre la abertura de la placa de plástico. Presione suavemente el cubreobjetos de vidrio sobre el anillo hecho de cinta adhesiva de doble cara.Tenga cuidado de no romper el vidrio. Gire el plato boca abajo y utilizar una pipeta P1000 para llenar la brecha entre la losa de agar que contiene las microcámaras y el depósito de agarosa con el líquido de agarosa de bajo punto de fusión se enfría a aproximadamente 30 ° C. Espere hasta que la agarosa se ha solidificado. Sellar el plato con una tapa. Para microscopios invertidos utilizar una tapa calentada. Para microscopios verticales utilizar una tapa normal y sellar el plato con Parafilm. Después de terminar la preparación de microcámaras, echa bajo un microscopio estereoscópico. El llenado correcto es crucial. Véase la discusión para más detalles. Imagen 4. Calcio Utilice cepas transgénicas que expresan sensores de calcio codificados genéticamente como HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3'UTR, UNC-119 (+)]) 27. Utilice un microscopio compuesto equipado para campo amplio de epifluorescencia. Conecte la salida TTL de la cámara a EMCCDla entrada de TTL del LED, de modo que cada vez que la cámara graba un marco de la muestra se iluminará. Utilice un tiempo de exposición de unos 5 ms. Utilice ganancia EM en el rango de 50 a 300. Especifique una película estallido funcionamiento durante 24 horas con cada gusano se toman las radiografías cada 15 – 30 min primero durante 20 segundos con la CID, a continuación, durante 20 s con una fluorescencia de GFP para grabar GCaMP y, a continuación, tomar una imagen final de la señal mKate2 se toma para de control para los niveles de expresión. Utilice una velocidad de 2 / seg durante cada ráfaga. Para la inspección visual de los datos, usar un mapa en color falso para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de fluorescencia. Datos fluorescentes trama como Df / F, con F es el valor promedio de la línea base de la fluorescencia. Una descripción detallada de análisis de datos de calcio se puede encontrar en la literatura 20. 5. Paralelo AMI de Múltiples Worms Coloque el plato que contiene las microcámaras en el microscopio, se centran en la muestra y realizar la autofocus. Establecer un protocolo de software para que la cámara adquiere una ráfaga de 40 cuadros de imagen en 20 segundos cada media hora durante 24 horas, lo que se traducirá en 1.920 fotogramas por gusano, una cantidad razonable de datos. Configurar la exploración de modo que visita cada gusano utilizando el escenario. Apunte para filmar unos 30 gusanos en una carrera. Imagen de varios gusanos por reducir el zoom, es decir, mediante un aumento menor. Use un aumento menor para cubrir varios microcámaras con el chip de la cámara y filmar varias microcámaras adyacentes al mismo tiempo. Tras el final de la adquisición de imágenes, separar los datos de cada cámara individual por recorte de una región de interés que cubre un animal. Para evaluar rápidamente los datos de movilidad, utilice la resta marco de 28-32. 6. Imaging Etapas de la vida diferente de C. elegans Utilice microcámaras de agarosa para todas las etapas de vida de C. elegans de L1 a adultos y entre ellos dauers. Utilice las dimensiones de la cámara apropiados para el DIFrentes etapas de la vida que se muestran en la Tabla 1. Etapa de la vida Tamaño de Cámara Profundidad de la cámara Tiempo de grabación normal Aumento L1 190 x 190 micras 10 – 15 micras huevo – mediados L2 400X L2 370 x 370 micras 15 micras huevo – L3 200X Dauer larvas 370 x 370 micras 25 micras 4 dias 200X L3 700 x 700 micras 45 micras L2 – L4 200X L4 700 x 700 micras 45 micras joven L4 – adulto joven 100X Adultos jóvenes 700 x 700 micras 45 micras </td> 12-24 h 100X Tabla 1. Cámara tamaños para diferentes etapas de la vida. Se muestran dimensiones de la cámara y aumentos que son útiles para diversas etapas optimizados para un chip de cámara de 8 x 8 mm.

Representative Results

Microcámaras de agarosa se ​​pueden aplicar a cualquier etapa de la vida de C. elegans. Como puede verse en la Figura 1A, el desarrollo larval y el comportamiento durante el sueño L1 lethargus pueden ser observados. Se muestran los tamaños de cámara que son 190 x 190 m, 10 m de profundidad. Si se requieren escalas de tiempo más largas, se pueden utilizar cámaras más grandes. Como puede verse en la Figura 1B, utilizando una cámara con dimensiones más grandes (370 x 370 m, 25 m de profundidad) permite el desarrollo de C. elegans desde el huevo hasta adulto. La Figura 1C muestra un análisis de los cambios a largo plazo en el comportamiento utilizando sustracción marco de un gusano crecido en una cámara de huevo hasta adulto. Se muestra son intensidades medias después de la sustracción del marco de las explosiones seleccionados durante la vigilia y lethargus. Cuanto menor es la intensidad media de los valores después de la resta marco es, menor es la movilidad del gusano. Se muestra se seleccionan los rastros de ráfaga de una condición estela y una condición lethargus por etapa larval. Losaumento observado en la intensidad media durante el desarrollo se debe principalmente a un aumento de contraste y el tamaño del animal. La Figura 1D muestra una larva dauer, una etapa de la vida alternativa que se dedica durante condiciones ambientales adversas 33. Tamaño de la cámara es de 370 x 370 m, 15 m de profundidad. Tenga en cuenta que la larva dauer se colocó en la cámara sin alimentos bacteriana, lo que provocaría la salida de la etapa larval dauer. La Figura 1E muestra un gusano adulto que ya ha establecido muchos huevos en la cámara. Dimensiones de la cámara se utilizan para el adulto son 700 x 700 m, 45 m de profundidad. Por último, la Figura 1F muestra un hermafrodita adulto y un apareamiento masculino dentro de una cámara de adultos. Imágenes de calcio en los gusanos móviles es posible con sensores de calcio GCaMP. Figuras 2A, B muestran imágenes de calcio del comando interneuron AVA para una larva L1 27. Figuras 2C, D muestran la actividad de calcio para la saMe tipo de neurona en un animal adulto. La ampliación de imagen a largo plazo es posible gracias a la digitalización y alejando el zoom. Figura 3A muestra la calidad de imagen de las imágenes simultánea de 30 gusanos en un único chip de la cámara con una cámara de 5 megapíxeles. La figura 3B muestra la calidad de imagen de 4 gusanos calcio fotografiado simultáneamente. Figura 1. Adaptación del IAM a todas las etapas de vida de C. elegans. (A) Larva fotografiado desde la primera hasta L1 L2 etapa temprana en 190 x 190 micras cámaras. (B) El desarrollo de huevo hasta adulto en una cámara de 370 x 370 m. (C) La movilidad de un gusano evaluó mediante la resta marco. Se muestra la intensidad media de todas las imágenes de la imagen después de la sustracción del marco para una película de ráfaga seleccionado para cada sta larvalge para despertar y el comportamiento lethargus. (D) Una larva dauer en ausencia de alimentos en una cámara de 370 micras x 370. Hermafrodita (E) para adultos con muchos huevos puestos en una cámara de 700 x 700 m. (F) El apareamiento de un macho y una hermafrodita en el interior de una cámara de 700 x 700 m. YA significa adulto joven. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. El calcio de imágenes con IAM. (A) de imágenes de calcio con GCaMP3 en el interneuron comando AVA de larvas L1 usando el promotor de RMN-1. Se muestran dos imágenes en falso color. En la imagen izquierda, la actividad de AVA es baja y el gusano no está haciendo un movimiento hacia atrás. En la imagen de la derecha de la actividad de AVA es de altura, y el gusano se está moviendo hacia atrás. transitorios (B) de calcio en el tiempo para un gusano de L1. (C, D) los transitorios de calcio en un animal adulto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Imaging varios gusanos en paralelo por el zoom a cabo. (A) de imágenes simultánea de 30 gusanos L1 por fotograma utilizando 190 x 190 micras cámaras y un aumento de 100X (usando un objetivo 10X) y un chip de la cámara 16,6 x 14 mm. (B) de formación de imágenes simultánea de cuatro gusanos L3 por trama utilizando 370 x 370 micras cámaras y un aumento de 100X y una región de interés de un chip de la cámara 16,6 x 14 mm.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hardware

El enfoque de un microscopio típicamente irá a la deriva durante la adquisición de imagen a largo plazo. Para microscopios compuestos, foco de mantenimiento de los sistemas se pueden comprar en los principales fabricantes de microscopios. En el caso de un microscopio compuesto con control de enfoque es demasiado caro, una alternativa sencilla sería utilizar un estereomicroscopio. Los microscopios compuestos permiten el uso de objetivos con alta apertura numérica (NA) y se puede automatizar fácilmente. Objetivos 40X petróleo son muy adecuadas. Lentes de inmersión de agua no son ideales debido a la evaporación durante la exploración a largo plazo. De contraste de interferencia diferencial (DIC) genera un contraste agradable que ayuda a seguir los cambios morfológicos y de comportamiento, pero las imágenes de campo brillante sencilla también se puede utilizar. Para DIC o imágenes de campo claro, utilizar la luz roja colocando un filtro de luz roja en el camino dia-iluminación del microscopio. Para la exploración de varios microcámaras una etapa automatizado es necesario. Mejor rendimiento es achieved cuando se utiliza una etapa que tiene la aceleración lineal y desaceleración y se puede ajustar a la baja velocidad de exploración para evitar molestar a los animales durante la exploración. No hemos observado respuestas conductuales o aumento de calcio en las neuronas mechanosensitive (ALM y PLM) durante la exploración, lo que sugiere que la exploración lenta de hecho no se activa el sistema mechanosensitive del gusano (datos no mostrados). Sistemas LED comerciales pueden ser utilizados. Varias compañías ofrecen soluciones listas para el uso que incluyen los LEDs en diferentes longitudes de onda. El LED debe tener la opción de activar externamente el LED con una señal TTL. Se necesita una cámara altamente sensible para la formación de imágenes de calcio de los animales en movimiento. Cámaras EMCCD son las cámaras más sensibles en el mercado. La cámara tiene que tener una salida TTL durante la exposición (también llamada de salida "fuego"). Se requiere un calentador de tapa para evitar la condensación en la tapa si se utiliza un microscopio invertido. En un microscopio vertical, se colocará el plato de manera que el wi tapall estar en el fondo y por lo tanto se evita la condensación y no se requiere calefacción tapa. La tapa bien debería cerrar el plato para evitar la evaporación del agua durante la exploración a largo plazo.

PDMS sellos

La superficie del sello PDMS que contiene la estructura para el moldeo de la agarosa se enfrenta lejos de la lámina de vidrio, que soporta el sello PDMS. Una lista con las empresas que ofrecen los chips de microfluidos personalizada se puede encontrar en Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Llenar los nematodos en sus cámaras

Este es el paso más crítico en el protocolo y los siguientes puntos deben ser considerados: A) La humedad de la agarosa es crucial para la transferencia de los gusanos y de imágenes. Si la agarosa es demasiado húmedo, es decir, hay un líquido covEring un área de varios microcámaras, no será posible distribuir alimentos bacteriana y gusanos de una manera controlada porque el líquido hará que las bacterias fluyen de distancia. Si la agarosa es demasiado seco entonces las bacterias y gusanos no pueden bajar el pick fácilmente lo que significa que el aumento de la fuerza debe ser utilizada para retirar los gusanos y bacterias que causan daño a la facilidad de agarosa. Al rellenar un montón de gusanos la agarosa puede secarse. En el peor de los casos la agarosa será tan seco en el extremo de que las cámaras se derrumbarán. Si la agarosa es demasiado seco puede ser rehidratado mediante la colocación de una pequeña gota (aproximadamente 2 l) de S-Basal sobre el lado del chip, donde no hay gusanos. Sumergir el alambre de platino recoger en el líquido e incluso tirar un poco de líquido en la zona donde las cámaras están llenas de gusanos. B) La cantidad de alimentos es fundamental para la imagen de éxito a largo plazo. Si no hay suficiente comida, los gusanos pueden quedarse sin ella. Si hay excesiva de alimentos de la cavidad de la cámara deno se comportan como un líquido sino más bien como un sólido y permitirá gusanos escapen de la cámara presionando las bacterias. Objetivo de obtener una suspensión bacteriana que llena toda la cámara. Los gusanos están en constante contacto físico con la superficie del agar y el vidrio a lo largo de la mayor parte de su longitud durante el experimento y el comportamiento de rastreo parece ser similar al movimiento en un plato y diferente a golear en líquido. C) Mecánica perjudicial de la agarosa puede arruinar el experimento. Una selección fina es esencial. No debe tener esquinas afiladas. Una pestaña suave unido a una punta de pipeta puede ser utilizado para mover las bacterias o los gusanos en las cámaras en lugar de utilizar una selección de platino. En la mayoría de casos, sin embargo, agarosa sobresecada es la razón de daños. La selección de pestañas o deberían, idealmente, sólo apenas tocar la agarosa en sí, y la película de agua sobre la superficie de agarosa debe sacar gusanos y bacterias. Cuando el sellado de las cámaras, de nuevo, la humedad de la agarosa es esencial. No deberíaser cualquier líquido libre en la superficie de agarosa porque esto puede lavar bacterias y gusanos durante el sellado. Las burbujas grandes pueden ser removidos por levantando suavemente una esquina de la losa de agar. Burbujas pequeñas que son menores que la cámara a menudo quedan atrapados dentro de las cámaras. Estas burbujas no son un problema y desaparecerán por absorción. Después de montar el plato, puedes volver a que la agarosa no es demasiado seco o demasiado húmedo. Las cámaras deben estar bien sellados y no debe haber ningún flujo de líquido entre las cámaras. Si la agarosa es demasiado húmeda, las cámaras no sellan correctamente. Los gusanos pueden escapar o su comida serán arrasadas. Si la muestra es demasiado húmedo, sencillo abrir la tapa y dejar secar agarosa durante un minuto o dos. Si la agarosa es demasiado seco, las cámaras pueden colapsar y los gusanos se escaparán.

La ampliación de zoom se aleja

Para imágenes de fluorescencia, reducir el zoom está limitada por la baja cantidad de luz obtenida a ampliaciones inferiores. También, EMCCD cámaras están optimizados para la sensibilidad y a menudo tienen una resolución relativamente baja. Sin embargo, la ampliación de imagen cuatro veces es bien posible. Por ejemplo, cuatro cámaras de 190 micras x 190 micras pueden caber en un fotograma utilizando 140X aumentos (logrado mediante el uso de un 20X Objetivo y una cámara 0.7X montaje) y un píxel de 512 x 512, 8 x 8 mm cámara. Una cámara de alta resolución con un chip grande (como cámaras sCMOS, 16,6 mm de chips x 14 mm, 2.560 x 2.560 píxeles = 5,5 megapíxeles) optimiza la ampliación de la CID y la imagen de campo claro. Por ejemplo, hasta 30 gusanos L1 en 190 micras x 190 micras cámaras pueden caber en cada marco de esta cámara cuando se utiliza un aumento de 100X (ver Figura 3). En principio, el zoom y el análisis también se pueden combinar para obtener incluso un mayor número de animales. La mayoría de las neuronas permanecen bastante bien en el foco, de modo que sólo un plano focal necesita ser fotografiado. Si se encuentran las neuronas que salir del foco, az exploración utilizando una unidad piezo se pueden tomar en cada tiempo pmixto.

La adaptación a diferentes comportamientos

Este protocolo da una buena idea de la conducta a través de escalas de tiempo largos. Obviamente, la temporización de las ráfagas necesita ser adaptado a diferentes comportamientos y etapas de la vida.

Limitaciones de la técnica

Hay varios factores que limitan la duración de la imagen. El más importante es la cantidad de comida. Una vez que se consume la comida, las larvas dejan de desarrollarse. Así, en pequeñas cámaras (190 x 190 m) gusanos se desarrollan hasta la etapa L3 y luego arrestan. Si se requiere mayor tiempo de formación de imágenes, las cámaras más grandes tienen que ser utilizados. La duración máxima de formación de imágenes a largo plazo está en el intervalo de 2,5 – 3 días. Si se requiere más tiempo de formación de imágenes, los gusanos necesitan ser recuperado y se colocaron en cámaras nuevas. Cuando la formación de imágenes gusanos adultos, otra limitación es causada por la descendencia de estos gusanos. Los gusanos adultos ponen huevos de larvas que eclosionan. Estas larvas también se quedará dentro de la cámara, Consumir alimentos, y puede perturbar el análisis de imágenes. Si descendencia es un problema, una solución es utilizar ya sea adultos estériles o para colocar repetidamente los gusanos en cámaras frescas. Para recuperar los gusanos, la losa de agarosa que contiene la cámara se corta libre con un bisturí, se tira de la cubreobjetos, y se coloca en una placa de NGM de la que los gusanos se pueden recuperar. Otro límite es la restricción de los gusanos a áreas relativamente pequeñas. Esto puede ser un problema si el movimiento de largo alcance debe ser analizado. Mientras que los animales en las cámaras pueden ser estimulados mecánicamente y optogenetically 21,27,34,35, la naturaleza sellada de la cámara hará que sea difícil de aplicar estimulantes solubles o volátiles. Los gases biológicamente importantes, tales como oxígeno o dióxido de carbono pueden difundir libremente en el agar. El gran depósito de aire en el plato debe mantener las concentraciones de gas en las cámaras constante durante el tiempo necesario para los experimentos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el concentratio local de oxígenon en la cámara pueden parecerse más a las condiciones que se encuentran en cultivo líquido de la cultura en el plato.

Importancia en relación con los métodos existentes

Dispositivos de microfluidos han avanzado mucho en el desarrollo del comportamiento y estudiado en C. elegans. A menudo, las estructuras de microfluidos están hechas de PDMS 12. Aquí se describe un protocolo para la generación de cámaras de cultivo de microfluidos hechos de agarosa. La fuerza de esta técnica es la combinación de una alta calidad de imagen, la correlación de la conducta con las mediciones fisiológicas, de imágenes a largo plazo, y un razonablemente alto rendimiento. Alta calidad de imagen se consigue mediante la formación de imágenes a través de la cubreobjetos utilizando altos objetivos de NA. Como resultado, imágenes de fluorescencia tales como imágenes de calcio y de formación de imágenes confocal de las estructuras subcelulares se puede realizar. Debido a que los animales no se inmovilizan como en otros sistemas, que permite una correlación de comportamiento con las mediciones fisiológicas. Because los animales tienen alimentos suficientes, continúan desarrollando permitiendo imágenes a largo plazo. Este sistema puede imagen muchos gusanos en una carrera porque los animales están restringidos a sus cámaras definidas. Por lo tanto, este método se puede escalar fácilmente hasta 9,27,34-36.

Las futuras aplicaciones

Hasta ahora, este sistema se ha utilizado principalmente para estudiar el comportamiento del sueño en C. elegans larvas L1. Sin embargo, la adaptación a todas las etapas hará posible el estudio de una amplia gama de comportamientos también en dauers y adultos. Una amplia gama de comportamientos se puede estudiar con esta técnica desde el apareamiento de la puesta de huevos.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La Sociedad Max Planck y un estipendio Göttingen Escuela Juvenil Grupo de HB financiaron este trabajo.

Materials

high-melting point agarose Fisher Bioreagents BP(E)164-1000
Top Vision Low Melting Point Agarose Thermo Scientific R0801
LED system CoolLED pE-2
compound microscope Nikon TiE
stereomicroscope Leica M5
EMCCD camera Andor iXon 897 now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera Andor Neo
plasma cleaner Harrick PDC-23G2
lid heater MPI workshop custom made
plastic dish Falcon 08-757-100A
z-stage for the microscope Prior Nano Scan Z
x-y-stage for the microscope Prior Proscan III
PDMS stamp Abbott Laboratories  custom made
red light filter Chroma ET660/50m
35mm petri dish Falcon Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning
double sided sticky tape Sellotape/Henkel double sided 12mm x 33 m alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.
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Referencias

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Turek, M., Besseling, J., Bringmann, H. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (100), e52742, doi:10.3791/52742 (2015).
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