Summary

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

Published: March 18, 2015
doi:

Summary

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Abstract

-Tronco pluripotentes derivadas de células cardiomiócitos Humanos induzida (hiPSC-CMS) tornaram-se uma importante fonte de células para suprir a falta de cardiomiócitos primários disponíveis para aplicações de pesquisa básica e translacional. Para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos, vários protocolos, incluindo corpo embryoid (EB) diferenciação baseada e indução do fator de crescimento têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são ineficientes e altamente variáveis ​​na sua capacidade para gerar cardiomiócitos purificadas. Recentemente, uma pequena protocolo utilizando modulação baseada molécula de sinalização Wnt / β-catenina foi mostrado para promover a diferenciação cardíaca com alta eficiência. Com este protocolo, superior a 50% -60% de células diferenciadas foram cardiomiócitos troponina positiva cardíacos foram observados de forma consistente. Para aumentar ainda mais a pureza de cardiomiócitos, as células diferenciadas foram sujeitas a inanição glicose para eliminar especificamente não-cardiomiócitos com base na diferença metabólicas entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Utilizando esta estratégia de selecção, que, consistentemente, obtido um aumento superior a 30% na proporção de cardiomiócitos a não cardiomiócitos em uma população de células diferenciadas. Estes cardiomiócitos altamente purificadas deverão aumentar a confiabilidade dos resultados de humano com base em estudos de modelagem em iPSC doença in vitro e testes de rastreio de drogas.

Introduction

Cardiomiócitos primários humanos são difíceis de obter devido à exigência de biópsias cardíacas invasivos, dificuldade em se dissociar para células individuais, e por causa da sobrevivência celular a longo prazo pobre em cultura. Devido a esta falta de cardiomiócitos humanos primários, induzida pelo homem-tronco pluripotentes cardiomiócitos derivados de células específicas do paciente tecnologia (hiPSC-CM) tem sido considerado como uma fonte de cardiomiócitos alternativa poderosa para a pesquisa básica, bem como as aplicações clínicas e translacionais como modelagem de doença e drogas descoberta 1. Os esforços iniciais em diferenciação de células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos empregues protocolos de diferenciação, usando corpos embrióides (EBS), mas este método é ineficiente porque em cardiomiócitos que produzem muitas vezes menos do que 25% de células em um EB são batendo cardiomiócitos 2,3. Comparativamente, um protocolo de diferenciação com base em monocamada utilizando as citocinas activina A e BMP4 exibida uma maior eficiência do que as EBs, maseste protocolo ainda é relativamente ineficiente, requer fatores de crescimento caros, e só funciona em um número limitado de pluripotentes humanas linhas de células estaminais 4. Recentemente, um protocolo de diferenciação de cardiomiócitos com base em monocamada hiPSC altamente eficiente foi desenvolvido pela modulação da sinalização de Wnt / β-catenina 5. Estes hiPSC-CMs expressar troponina T cardíaca e alfa actinina, duas proteínas sarcoméricas que são marcadores padrão de cardiomiócitos 6. O protocolo de descrever aqui é uma adaptação deste pequeno-base molécula, alimentador de célula livre, diferenciação monocamada método 5,7. Nós somos capazes de obter bater cardiomiócitos de hiPSCs após 7-10 dias (Figura 1). No entanto, seguindo uma diferenciação de cardiomiócitos resultando em 50% de células batendo, de forma consistente imunomarcação mostra a existência de uma população de cardiomiócitos que não são negativas para os marcadores específicos de cardiomiócitos, tais como a troponina T cardíaca específica e alfa-actinina. Para further purificar cardiomiócitos e eliminar não-cardiomiócitos, populações heterogéneas de células diferenciadas foram submetidos a jejum de glucose, tratando-os com um meio extremamente baixo de glucose para a cultura de vários dias (Figura 2). Este tratamento elimina selectivamente não-cardiomiócitos, devido à capacidade de cardiomiócitos, mas não não-cardiomiócitos, para metabolizar lactato como fonte de energia primária, a fim de sobreviver em um ambiente de baixa glicose 8. Após esta fase de purificação, é observado um aumento de 40% na proporção de cardiomiócitos para não-cardiomiócitos, (Figura 3, Figura 4) e estas células podem ser utilizadas para análise da expressão do gene a jusante, modelagem doença, e ensaios de rastreio de drogas.

Protocol

NOTA: As informações fornecedor para todos os reagentes utilizados neste protocolo foi listado na Tabela 1 e Lista de Materiais. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células têm de ser estéreis e técnica asséptica deve ser utilizado em conformidade. Executar todas as incubações de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2, a menos que especificado de outra forma. Neste protocolo, todas as diferenças são realizadas em pla…

Representative Results

As alterações morfológicas durante a diferenciação hiPSC. O hiPSC cultivadas em placas de livre-de alimentação cresceu como planas, colônias bidimensionais. Ao atingir cerca de 85% de confluência, hiPSCs foram tratados com 6 uM CHIR para diferenciação (Figura 1A). Quantidades substanciais de morte celular, um fenômeno normal e comum, foram observados após 24 horas de tratamento CHIR. Depois de dois dias de tratamento com CHIR, os hiPSCs continua…

Discussion

A obtenção de uma grande quantidade de derivados de cardiomiócitos hiPSC altamente purificadas é crítica para a investigação básica cardíaca, bem como aplicações clínicas e translacionais. Protocolos de diferenciação cardíacos tenham sido submetidos a enormes melhorias nos últimos anos, a transição de métodos baseados em corpo embri�des utilizando crescimento cardiogênico fatores 2, a matriz métodos sanduíche 12 e, finalmente, para as pequenas métodos baseados monocamada…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

Materials

Name Company Catalog number
Matrigel (9-12 mg/mL) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

Referencias

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Citar este artículo
Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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