גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
cardiomyocytes מקורן בתאי גזע pluripotent אדם מושרה (hiPSC-CMS) הפך מקור תא חשוב להתייחס לחוסר cardiomyocytes העיקרי זמין עבור יישומי מחקר וtranslational בסיסיים. להבדיל hiPSCs לשריר לב, פרוטוקולים שונים, כוללים גוף embryoid (EB) בידול מבוסס ואינדוקצית גורם הגדילה פותחו. עם זאת, פרוטוקולים אלה אינם יעילים ומשתנים מאוד ביכולתם ליצור cardiomyocytes המטוהר. לאחרונה, אפנון פרוטוקול ניצול קטן על בסיס מולקולות איתות Wnt / β-קטנין הוצג לקידום בידול לב עם יעילות גבוהה. עם פרוטוקול זה, יותר מ -50% -60% מתאים מובחנים היו cardiomyocytes טרופונין חיובי לב נצפו באופן עקבי. כדי להגדיל את טוהר cardiomyocyte נוסף, התאים המובחנים היו נתונים לגלוקוז רעב לחסל במיוחד שאינו cardiomyocytes המבוסס על ההבדל מטבוליםים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes. באמצעות אסטרטגית בחירה זו אנו באופן עקבי השגנו עלייה גדולה יותר מ -30% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes באוכלוסייה של תאים מובחנים. cardiomyocytes הנקי במיוחד אלה צריכים לשפר את האמינות של תוצאות מאדם מבוסס iPSC בלימודי דוגמנות המחלה מבחנה ומבחני הקרנת סמים.
Introduction
cardiomyocytes אדם מן המעלה הראשון הם קשה להשגה בגלל הדרישה לביופסיות לב פולשנית, קושי במתנער לתאים בודדים, ובגלל הישרדות תא לטווח ארוך עניה בתרבות. בהתחשב בזה חוסר cardiomyocytes האנושי הראשוני, cardiomyocyte מקורן בתאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מטופל ספציפי טכנולוגיה (hiPSC-CM) כבר נחשבה כמקור עוצמה חלופי cardiomyocyte למחקר בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational כגון דוגמנות מחלה ותרופה תגלית 1. מאמצים מוקדמים בתאי גזע pluripotent לcardiomyocytes מועסקים פרוטוקולי בידול באמצעות גופי embryoid (EBS), אך שיטה זו אינה יעילה בשריר לב בהפקת כי לעתים קרובות פחות מ -25% מתאים בEB מכים cardiomyocytes 2,3. יחסית, פרוטוקול בידול המבוסס על monolayer באמצעות ציטוקינים Activin וBMP4 מוצג יעילות גבוהה יותר מאשר EBS, אבלפרוטוקול זה הוא עדיין יחסית לא יעיל, דורש גורמים יקרים צמיחה, ופועל רק במספר מצומצם של שורות תאי גזע האנושי pluripotent 4. לאחרונה, פרוטוקול יעיל ביותר, המבוסס על monolayer hiPSC בידול cardiomyocyte פותח על ידי ויסות Wnt / β-קטנין איתות 5. אלה hiPSC-CMS להביע T לב טרופונין וactinin אלפא, שני חלבונים sarcomeric שהם סמנים סטנדרטיים של cardiomyocytes 6. הפרוטוקול מתאר כאן הוא עיבוד של,, 5,7 זה קטן על בסיס מולקולות תא מזין ללא הבחנה monolayer שיטה. אנו מסוגלים להשיג להכות cardiomyocytes מhiPSCs לאחר 7-10 ימים (איור 1). עם זאת, בעקבות בידול cardiomyocyte וכתוצאה מכך 50% הכו את התאים, immunostaining באופן עקבי מראה את קיומה של אוכלוסייה הלא-cardiomyocytes כי הם שליליים לסמני cardiomyocyte הספציפי כגון T טרופונין הלבבי ספציפי ואלפא-actinin. לפוrther לטהר cardiomyocytes ולחסל הלא cardiomyocytes, אוכלוסיות תאים מובחנות הטרוגנית היו נתונים לגלוקוז רעב תוך התייחסות אליהם עם מדיום תרבות גלוקוז נמוך מאוד במשך ימים רבים (איור 2). טיפול זה באופן סלקטיבי מבטל הלא cardiomyocytes בשל היכולת של שריר לב, אך לא בלתי-cardiomyocytes, לחילוף חומרים לקטט כמקור האנרגיה העיקרי על מנת לשרוד בסביבת גלוקוז נמוכה 8. לאחר שלב טיהור זה, עלייה של 40% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes הוא ציין, (איור 3, איור 4) ותאים אלה יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם ביטוי גנים, דוגמנות מחלה, ומבחני הקרנת סמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
קבלת כמות גדולה של שריר לב הנגזר hiPSC נקי במיוחד היא קריטית למחקר לב בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational. פרוטוקולי בידול לב עברו שיפורים עצומים בשנים האחרונות, מעבר משיטות המבוסס על גוף embryoid ניצול צמיחת קרדיוגני גורמים 2, למטריצת שיטות כריך 12, ולבסוף לשי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
Referencias
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
