Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

Cardiomyocytes humains primaires sont difficiles à obtenir en raison de l'obligation pour les biopsies cardiaques invasifs, de la difficulté à dissocier les cellules simples, et parce que de mauvaise survie des cellules à long terme dans la culture. Compte tenu de ce manque de cardiomyocytes humains primaires, souches pluripotentes humaines induites cardiomyocytes dérivés de cellules spécifiques au patient (hiPSC-CM) la technologie a été considérée comme une source de cardiomyocytes alternative puissante pour la recherche fondamentale ainsi que des applications cliniques et translationnelles telles que la modélisation de la maladie et de drogues ^une découverte. Les premiers efforts dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes employés protocoles de différenciation en utilisant des corps embryoïdes (EBS), mais cette méthode est inefficace dans les cardiomyocytes produisant parce que souvent moins de 25% des cellules dans une EB battent cardiomyocytes ^2,3. Comparativement, un protocole de différenciation en fonction monocouche à l'aide des cytokines activine A et BMP4 affiche un rendement plus élevé que EBS, maisce protocole est encore relativement inefficace, nécessite des facteurs de croissance coûteux, et ne fonctionne que dans un nombre limité de lignées de cellules souches pluripotentes humaines ^4. Récemment, un très efficace, le protocole de différenciation des cardiomyocytes base-monocouche hiPSC a été développé par la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine ^5. Ces hiPSC-CMS exprimer troponine T cardiaque et l'alpha actinine, deux protéines sarcomériques qui sont des marqueurs standard de ⁶ cardiomyocytes. Le protocole décrit ici est une adaptation de cette petite base de molécule, chargeur acellulaire, la différenciation monocouche méthode ^5,7. Nous sommes en mesure d'obtenir des cardiomyocytes battant hiPSCs après 7-10 jours (figure 1). Cependant, suite à une différenciation des cardiomyocytes résultant dans 50% des cellules battant, immunocoloration constante montre l'existence d'une population de non-cardiomyocytes qui sont négatives pour les marqueurs spécifiques tels que des cardiomyocytes troponine T spécifiquement cardiaque et d'alpha-actinine. Pour fucomplémen cardiomyocytes purifier et d'éliminer les non-cardiomyocytes, des populations hétérogènes de cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose en les traitant avec un milieu de culture de glucose extrêmement faible pendant plusieurs jours (figure 2). Ce traitement élimine sélectivement les non-cardiomyocytes en raison de la capacité des cardiomyocytes, mais pas non cardiomyocytes, à métaboliser le lactate comme source d'énergie primaire pour survivre dans un environnement faible taux de glucose ^8. Après cette étape de purification, on observe une augmentation de 40% du rapport des cardiomyocytes de non-cardiomyocytes, (figure 3, figure 4) et ces cellules peuvent être utilisées pour aval analyse de l'expression génique, la modélisation de la maladie, et des essais de criblage de médicaments.