The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
Кишечной нервной системы (ЭНС) состоит из двух ganglionated сплетений встроенных в стенке желудочно-кишечного тракта 1. Эти внутримышечные нейронные цепи, мышечной оболочки кишечника сплетение (MP) и подслизистого сплетения (SMP), состоят из нейронов и кишечной глии (рисунок 1) 2. MP и SMP регулировать желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) функции, такие как моторики кишечника и эпителия поглощения и секреции, соответственно 3. Кишечная глия находятся в непосредственной близости от нейронов внутри ганглиев, но популяций кишечной глии существуют также и в смежных волокон брошюры и экстра-ганглиозные части стенки кишечника 3,4. Кишечные глиальные клетки были первоначально считали только для обеспечения питательной поддержки нейронов. Однако, недавние исследования убедительно свидетельствуют, что нейрон-глия взаимодействия имеют важное значение для ENS действует 5,6. Например, данные показывают, что кишечно-глии "слушать" нейронной активности 7и модулировать нейронные схемы 6,8, защиты энтеросолюбильной нейроны от окислительного стресса и 9 способны генерировать новые энтеросолюбильной нейронов в ответ на повреждение 10,11. Протокол, представленные в данном техническом обзоре обеспечивает простой и надежный метод для изучения сложных взаимосвязей между нейронами и кишечной глии, используя на месте внутриклеточного Ca 2+ изображений.
Ca 2+ повсеместно сигнальная молекула в возбудимых клеток и играет важную роль в синаптических сигнальных событий в нервной системе 12. Возбуждение нейронов или кишечной глии вызывает возвышение в цитоплазматической Ca 2+ концентрации либо притоком через Са 2+ -permeable каналов или Са 2+ релиз из внутриклеточных депо кальция. Изображениями Ca 2+ в нейронах и глии с люминесцентными красителями и широко используемый метод для изучения функциональной организации и динамикиENS 13-17. Изображениями Ca 2+ было показано, чтобы быть важным инструментом в изучении сегменты неповрежденной GI тканей для выяснения распространения возбудимости через ICC кардиостимулятора сетей 18 и кишечника гладкой мускулатуры 19,20. Это позволяет исследователям исследовать широкий спектр физиологических параметров и предоставляет информацию о как их пространственного распределения и временной динамики. Клетки могут быть эффективно окрашивали в минимально инвазивной образом с помощью мембранных проницаемым люминесцентные индикаторы и оптимизированные протоколы окрашивания 21. Это дает возможность контролировать большое количество нейронов и глии в кишечно функционально сохраненных препаратов 14-16,22, а также в естественных условиях 23. Целые-крепление ткани препараты основная загружается с высоким сродством Ca 2+ индикатора красителя, таких как Fluo-4, что повышает его флуоресценции при связывании с Са 2+. Изменение флуоресценции регистрируются ПЗС-камеры и Анализируется в цифровом 6. Появление Ca 2+ предоставляется возможность отслеживать нейронов и глии межклеточных взаимодействий, отзывчивость на различные раздражители, и участие этих типов клеток в желудочно-кишечной процессов в режиме реального времени.
В месте с изображениями Ca 2+ дала большое понимание в сигнальных механизмов кишечных нейронов и глии и обладает рядом явных преимуществ по сравнению с моделями клеточных культур 6,24. Во-первых, на месте препараты сохранить родной матрицы среду нейронов и глии и оставить большую часть своих связей с целевой ткани нетронутыми. Во-вторых, генетика и морфология культивируемых кишечной глии существенно изменяются по сравнению с в естественных условиях 6,24. В-третьих, многие гетеротипические взаимодействия теряются в первичной культуры клеток, и это ограничивает оценивающие межклеточных взаимодействий. Хотя культивируемые клетки хорошо подходят для исследования фундаментальных свойств, их usefulneСС для изучения сложных взаимодействий между кишечными глии и нейронов ограничена. Исследование нейрон-глия взаимодействие с использованием на месте подход является более физиологически актуальна как синаптические пути остаются нетронутыми 25. По сравнению с клеточной культуры подходов, на месте подхода предлагает улучшенные условия для систематического понимания сложных взаимодействий между нейронами и кишечной глии. Кроме того, плоская организация ganglionated сплетения в целом монтажа подготовки идеально подходит для флуоресцентных изображений внутриклеточных Са 2+ и этот метод обеспечивает простой подход для оценки Нейрон-глии деятельность в ENS.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |