The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
장 신경계 (ENS)는 소화 기관 (1)의 벽에 내장 된 두 개의 ganglionated 얼기으로 구성되어 있습니다. 이 근육 내 신경 회로는, myenteric 신경 얼기 (MP) 및 점막하 신경총 (SMP)은 신경 세포와 장 아교 세포 (그림 1)이 구성된다. MP와 SMP는 장 운동 및 상피 흡수와 분비, 각각 3과 위장관 (GI)의 기능을 조절한다. 장내 아교 세포가 신경 내의 신경 세포 만 장 아교 세포의 인구 가까이에 위치하고 있습니다 또한 섬유 책자 및 창자 벽 3,4의 추가-신경절 부분을 상호 연결 내에 존재한다. 장내 아교 세포는 원래 신경 세포 만 영양 지원을 제공하기 위해 믿었다. 그러나 최근의 연구는 강하게 ENS는 5,6 기능에 대한 신경 세포 – glia 상호 작용이 필수적하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 데이터는 장 아교 세포가 신경 세포의 활동 7 "수신"보여그리고, 신경 회로 6,8- 변조 산화 스트레스 (9)로부터 장용성 뉴런을 보호하고 10,11 부상에 응답하여 새로운 장용성 뉴런을 생성 할 수있다. 이 기술 검토에 제시된 프로토콜은 현장 세포 내 칼슘 이미징 사용 신경과 장 아교 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 조사하는 간단하고 강력한 방법을 제공한다.
칼슘은 흥분성 세포에서 유비쿼터스 신호 분자와 신경 시스템 (12)에서 시냅스 신호 이벤트에 필수적인 역할을한다. 신경 세포 또는 장내 아교 세포의 여기 어느 유입에 의해 칼슘 -permeable 채널 또는 CA를 통해 세포 내 칼슘 상점에서 2 + 릴리스 세포 내 칼슘 농도의 상승을 이끌어 낸다. 이미징 CA의 형광 염료와 뉴런과 교세포에서 2 + 과도은 설립과 기능 조직과의 역학을 연구하는 널리 사용되는 기술이다ENS 13-17. 칼슘 이미징은 ICC의 심장 박동 네트워크 18 장 평활근 (19, 20)을 통해 흥분의 확산을 명료하게 그대로 GI 조직 세그먼트를 공부하는 중요한 도구가 될 것으로 나타났다. 그것은 생리 학적 매개 변수의 넓은 스펙트럼을 조사하는 연구를 가능하게하고 자신의 공간 분포와 시간적 동력학에 대한 정보를 제공합니다. 세포를 효율적으로 막 투과성 형광 염색 지표와 최적화 프로토콜 (21)을 이용하여 최소 침습 방식으로 염색 할 수있다. 이는 생체 내 23뿐만 아니라 기능적으로 보존 제제 14-16,22에 다수의 뉴런 및 신경교 장용성를 모니터링 할 수있는 기회를 제공한다. 전체 – 마운트 조직 제제는 칼슘 결합하면 그 형광을 증가 FLUO-4로 고친 화성 칼슘 지시 염료 로케이션 벌크있다. 형광의 변화는 CCD 카메라와 아나 기록디지털 6 분석하였으며. 칼슘의 출현은 다양한 자극에 대한 신경 세포 및 글 리아 세포의 상호 작용, 응답을 모니터링 할 수있는 기회 및 실시간 프로세스 위장관에서 이러한 세포 유형의 개입을 제공 하였다.
현장에서 칼슘 이미징은 장 신경 세포와 아교 세포의 신호 전달 메커니즘에 큰 통찰력을 산출하고 세포 배양 모델 6,24에 비해 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고있다. 먼저, 반응계에서 제제는 뉴런 및 신경교의 기본 매트릭스 환경을 그대로 유지하고 조직을 대상으로 그 커넥터의 대부분을 떠난다. 둘째, 유전학 및 배양 장 아교 세포의 형태는 크게 생체 6,24에 비해 변경된다. 셋째, 많은 이형 상호 작용 1 차 세포 배양 손실과 세포 – 세포 상호 작용을 평가하는이 제한됩니다. 배양 된 세포는 잘 기본적인 특성 조사, 그들의 usefulne에 적합하지만장 아교 세포와 신경 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 연구 SS 제한됩니다. 시냅스 경로 (25) 그대로 남아있는 현장에 접근 방법을 사용하여 조사하는 신경 세포 – glia의 상호 작용은 더 생리 학적으로 관련이있다. 세포 배양 방법에 비하여 시츄 접근 체계적 신경원과 신경교 장용성 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기위한 개선 된 조건을 제공한다. 또한, 전체 마운트 준비에 ganglionated 신경총의 평면 조직은 세포 내 칼슘 과도의 형광 이미징에 이상적이며,이 기술은 ENS에서 신경 세포 아교 세포의 활동을 평가하기위한 간단한 방법을 제공합니다.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |