The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
Das enterische Nervensystem (ENS) ist in zwei ganglionated Plexus in der Wand des Verdauungstraktes 1 eingebettet organisiert. Diese intramuskuläre neuronalen Schaltkreise, die Plexus myentericus (MP) und submuköse Plexus (SMP), werden von Neuronen und Glia magensaftresistenten (Abbildung 1) 2 zusammen. Die MP und SMP Regulierung gastrointestinale (GI) Funktionen wie Motilität und epithelialen Absorption und Sekretion bzw. 3. Magensaftresistente Gliazellen sind in unmittelbarer Nähe zu Neuronen im Ganglion aber Populationen von magensaftresistenten Glia befindet Darüber hinaus bestehen innerhalb verbindenden Faserbahnen und außerGangLien Teile der Darmwand 3,4. Magensaftresistente Gliazellen wurden ursprünglich angenommen, dass nur nutritive Unterstützung Neuronen liefern. Doch neuere Studien deuten stark darauf hin, dass Neuron-Glia Interaktionen sind für die ENS-Funktionen 5,6. Zum Beispiel Daten zeigen, dass enterische Glia "hören" neuronale Aktivität 7und Modulieren neuronaler Schaltkreise 6,8, enterischen Neuronen zu schützen vor oxidativem Stress 9 und sind in der Lage zur Erzeugung von neuen enterischen Neuronen in Reaktion auf eine Verletzung 10,11. Die in diesem Beitrag vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und robuste Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Neuronen und Glia enterische Verwendung von in situ intrazellulären Ca 2+ Bildgebung zu untersuchen.
Ca 2+ ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül in erregbaren Zellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Signalereignisse im Nervensystem 12. Die Anregung der Neuronen oder Gliazellen ente löst eine Erhebung in cytoplasmatischen Ca 2+ -Konzentration entweder durch Einstrom durch Ca 2+ durchlässige Kanäle oder Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern. Imaging Ca 2+ Transienten in Neuronen und Glia mit fluoreszierenden Farbstoffen ist eine etablierte und weit verbreitete Technik, um die funktionelle Organisation und Dynamik zu studierendie ENS 13-17. Ca2 + Imaging hat sich gezeigt, ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung intakt GI Gewebesegmente, um die Ausbreitung der Erregbarkeit durch ICC Schrittmacher Netzwerke 18 und Darm der glatten Muskulatur 19,20 aufzuklären sein. Es ermöglicht es Forschern, ein breites Spektrum von physiologischen Parametern zu untersuchen und liefert Informationen über sowohl die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik. Die Zellen können effizient in einem minimal-invasiven Weise unter Verwendung membranpermeable Fluoreszenzindikatoren und optimierte Färbeprotokollen 21 gefärbt werden. Dies bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Neuronen und Glia ente in funktionell erhaltenen Zubereitungen 14-16,22 überwachen, sowie in vivo 23. Whole-mount Gewebezubereitungen Masse mit einer hochaffinen Ca 2+ Indikatorfarbstoff beladen, wie Fluo-4, das seine Fluoreszenz steigt, wenn Ca 2+ gebunden. Veränderungen in der Fluoreszenz werden durch eine CCD-Kamera und ana zeichnetensiert digital 6. Das Aufkommen von Ca 2+ bot die Gelegenheit, Neuronen und Gliazellen Zell-Interaktionen, Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize zu überwachen und die Beteiligung dieser Zelltypen im Magen-Darm-Prozesse in Echtzeit.
In situ ist Ca2 + Imaging großen Einblick in die Signalmechanismen von enterischen Neuronen und Glia ergab und besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber Zellkulturmodellen 6,24. Zum einen in situ Vorbereitungen halten die native Matrix-Umgebung von Neuronen und Glia und lassen den Großteil ihrer Verbindungen zu Gewebe intakt Ziel. Zweitens werden die Genetik und die Morphologie der kultivierten ente Glia signifikant verändert im Vergleich zu in vivo 6,24. Drittens werden viele hetero Wechselwirkungen in primären Zellkultur verloren, und diese Grenzen der Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl kultivierten Zellen sind gut für die Untersuchung der fundamentalen Eigenschaften, die usefulne geeignetss für die Untersuchung komplexer Interaktionen zwischen enterischen Gliazellen und Neuronen ist begrenzt. Untersuchung von Neuron-Glia-Wechselwirkung mit einem in situ Ansatz ist physiologisch relevant wie die synaptischen Bahnen intakt 25 bleiben. Im Vergleich zu Zellkulturansätzen, eine in-situ-Ansatz bietet bessere Bedingungen für die systematische Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gliazellen ente. Darüber hinaus ist die planare Organisation der ganglionated Plexus ganz Montage Präparate ideal für Fluoreszenz-Bildgebung des intrazellulären Ca 2+ Transienten und diese Technik bietet eine einfache Methode zur Bewertung Neuron-Glia-Aktivität im ENS.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |