The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
מערכת העצבים enteric (ENS) מאורגנת בשני plexuses ganglionated המוטבע בקיר של מערכת עיכול 1. מעגלים עצביים לשריר אלה, מקלעת myenteric (MP) ומקלעת submucosal (SMP), מורכבים מתאי עצב וגליה enteric (איור 1) 2. MP וSMP להסדיר עיכול פונקציות (GI) כגון תנועתיות מעיים וספיגת אפיתל והפרשה, בהתאמה 3. גליה מעיים נמצאות בסמיכות לתאי עצב בתוך הגרעינים אבל אוכלוסיות של גליה enteric גם קיימות בתוך מקשר קטעי סיבים וחלקים נוספים-ganglionic של קיר בטן 3,4. גליה מעיים האמינו במקור כדי לספק תמיכה תזונתית רק לתאי עצב. עם זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך שנוירון, גליה אינטראקציות חיוניות לENS מתפקד 5,6. לדוגמא, הנתונים מראים כי גליה enteric "להקשיב" לפעילות עצבית 7ולווסת את המעגלים עצביים 6,8, להגן על תאי עצב enteric מלחץ חמצוני 9 והם מסוגלים לייצר תאי עצב חדשים enteric בתגובה לפציעה 10,11. הפרוטוקול המובא בסקירה טכנית זו מספק שיטה פשוטה וחזקה כדי לבחון את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וגליה enteric באמצעות הדמיה Ca 2 + תאית אתרו.
Ca 2 + הוא מולקולת איתות בכל מקום בתאים להתרגש וממלא תפקיד חיוני באירועי איתות הסינפטי במערכת העצבים 12. עירור של תאי עצב או גליה enteric מעורר העלאה בריכוז Ca 2 + cytoplasmic או על ידי זרם דרך Ca 2 + ערוצי -permeable או Ca 2 + שחרור מחנויות סידן תוך תאי. ההדמיה Ca 2 + ארעיים בתאי עצב וגליה עם צבעי ניאון הוא הוקם וטכניקה בשימוש נרחבת כדי ללמוד את הארגון ואת הדינמיקה של תפקודיים13-17 ENS. ההדמיה Ca 2 + הוכח להיות כלי חשוב בלימוד קטעי רקמה במערכת העיכול ללא פגע על מנת להבהיר את ההתפשטות של רגישות באמצעות רשתות ICC קוצב לב 18 ושריר חלק במעי 19,20. זה מאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של פרמטרים פיסיולוגיים ומספק מידע על שתי הפריסה המרחבית שלהם ודינמיקה זמנית. תאים יכולים להיות מוכתמים ביעילות באופן פולשנית ידי שימוש באינדיקטורים ניאון קרום חדיר ופרוטוקולים מכתים מותאמים 21. זה מציע הזדמנות לעקוב אחר מספר גדול של תאי עצב וגליה enteric בהכנות השתמרו תפקודי 14-16,22, כמו גם in vivo 23. הכנות רקמת הר-שלמות הן בתפזורת עמוסה Ca 2 + צבע מחוון גבוהה זיקה כגון Fluo-4, המגבירה הקרינה שלה כאשר חייב Ca 2 +. שינויים בקרינה נרשמים על ידי מצלמת CCD וanaדיגיטלי 6 lyzed. כניסתו של Ca 2 + סיפקה את ההזדמנות כדי לפקח על אינטראקציות תא עצב ותאי גליה, היענות לגירויים שונים, ומעורבותם של סוגי התאים בתהליכי עיכול בזמן אמת.
באתר ההדמיה Ca 2 + הניבה תובנה גדולה לתוך מנגנוני האיתות של תאי עצב וגליה enteric ובעל כמה יתרונות ברורים על פני דגמי תרבית תאים 6,24. ראשית, באתר הכנות לשמור על סביבת מטריצת יליד נוירונים וגליה ולהשאיר את חלק הארי של הקשרים שלהם כדי למקד את הרקמה שלמה. שנית, הגנטיקה והמורפולוגיה של גליה enteric בתרבית באופן משמעותי בהשוואה לשינו in vivo 6,24. שלישית, אינטראקציות רבות heterotypic הולכים לאיבוד בתרבית תאים ראשוני וזה מגביל הערכת אינטראקציות תא-תא. למרות שתאים בתרבית מתאימים גם לחקירה של תכונות בסיסיות, usefulness לחקר אינטראקציות מורכבות בין גליה ונוירונים enteric מוגבל. גומלין נוירון, גליה חוקר באמצעות באתר גישה הוא יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמסלולים הסינפטי נותרו על כנן 25. בהשוואה לגישות תרבית תאים, בגישה באתר מציע תנאים משופרים לשיטתיים הבנת האינטראקציות המורכבות בין תאי עצב וגליה enteric. יתר על כן, הארגון מישוריים של מקלעת ganglionated בהכנות כל הר הוא אידיאלי עבור הדמיה ניאון של Ca 2 + ארעיים תאיים וטכניקה זו מספקת גישה פשוטה להערכת פעילות נוירון, גליה בENS.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |