Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems
Summary
Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Abstract
Plackanalyser är fortfarande en av de mest exakta metoder för direkt kvantifiering av infektiösa vironer och antivirala substanser genom räkning av diskreta plack (infektiösa enheter och cellulära döda zoner) i cellkultur. Här visar vi hur du utför en grundläggande plackanalys, samt hur skilda över och tekniker kan påverka plackbildning och produktion. Typiskt fasta eller halvfasta overlay substrat, såsom agaros eller karboximetyl-cellulosa, har använts för att begränsa viral spridning, förebygga urskillningslös infektion genom vätsketillväxtmedium. Immobiliserade över begränsar cellulär infektion till närmast omgivande monoskiktet, vilket gör att bildandet av diskreta kvantifierbart foci och efterföljande plackbildning. För att övervinna de svårigheter som är förknippade med att använda traditionella över, en ny flytande över utnyttjar mikrokristallin cellulosa och karboximetylcellulosanatrium har blivit allt vanligare som en ersättning i standardenplackanalys. Flytande overlay plackanalyser kan lätt utföras i antingen standard 6 eller 12 och plattformat enligt traditionella tekniker och kräver ingen speciell utrustning. På grund av dess flytande tillstånd och efterföljande enkel applicering och borttagning, kan mikrokulturplattformat alternativt användas som en snabb, korrekt och hög kapacitet alternativ till större skala virala titreringar. Användning av en icke uppvärmd viskös flytande polymer ger möjlighet att effektivisera arbetet, sparar reagenser, inkubator utrymme och ökar driftsäkerheten vid användning i traditionella eller höga inneslutningslaboratorier som ingen uppvärmning av reagens eller glas krävs. Flytande över kan också visa sig vara känsligare än traditionella överlägg för vissa värme labila virus.
Introduction
Den exakta isolering och kvantifiering av livskraftiga virusprover har alltid varit ett pågående forskningsprojekt mål i virologi. Det var inte förrän tillkomsten av plackanalys 1952 som ett medel för att kvantitativt och kvalitativt beräkna djurens virustitrar utvecklades först 1,2. Denna teknik var först anpassas och modifieras från fag-analyser, som tidigare hade använts för att beräkna titrar av stock bakteriofager i växtbiologi 1,2. Även alternativa metoder för viral kvantifiering har sedan utvecklats och anpassats, såsom immun, fluorescens och transmissionselektronmikroskop, avstämbara resistiv puls avkänning (TRPS), flödescytometri, rekombinanta reportersystem, och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Dessa metoder misslyckas med att identifiera och kvantifiera replikationskompetenta vironer 1,3. Medan framsteg inom teknik och tekniker fortsätter att förfina och förändra landskapet; plaque-analyser utgör fortfarande den gyllene standarden för att bestämma virushalter för smitt lytiska vironer 1,4.
Under en plackanalys, är ett sammanflytande monolager av värdceller infekterade med en lytisk virus av en okänd koncentration som har seriespäddes till en uppräknelig intervall, vanligtvis mellan 5-100 virioner. Infekterade mono täcks sedan med en immobiliserande overlay medium för att förhindra viral infektion från urskillningslöst sprider sig genom antingen mekanisk eller convectional flöde av det flytande mediet under viral förökning. Medan fasta eller halvfasta överlag såsom agaros, metylcellulosa eller karboximetylcellulosa (CMC) har traditionellt använts, har flytande beläggningar blivit ett alltmer attraktivt alternativ med utveckling av nya flytande övertäckningar, såsom Avicel 5- 7. Plackanalyser som använder flytande kontra traditionella över har flera fördelar som överlagringen kan vara applied vid rumstemperatur, och applicering och borttagande är betydligt enklare. Som flytande överlag inte kräver uppvärmning, kan känsliga och värme labila virus också vara lättare att plack.
Efter den initiala infektionen och tillämpning av den immobiliserande overlay, individuella placker, eller zoner av celldöd, kommer att börja utveckla såsom viral infektion och replikation är begränsade till den omgivande monoskiktet. Infekterade celler fortsätter repliker-lys-infektionscykeln vidare smittan sprids, vilket resulterar i allt mer distinkta och diskreta plack. Beroende på den virala tillväxt kinetik och värdcell som används, kommer en synlig plack normalt bildar inom 2-14 dagar. Cellulära monoskikt kan sedan räknas med en standardljusfältmikroskop, eller mer typiskt fast och motfärgades med neutralrött eller kristall våldsamt för att lätt identifiera plack med blotta ögat. Det finns ett brett utbud av plack motverka fläckar tillgängliga, varje erbjudande thEIR specifika fördelar och nackdelar. Crystal violet sätts typiskt vid punkten för insamling och efter upptagningen / borttagning av overlay, vilket ger en snabb och tydlig disk fläck som möjliggör identifiering av mycket små plack när blandad morfologi är närvarande. Neutral rött har fördelen av tidig tillämpning och ständig kontakt med overlay, vilket möjliggör live övervakning av utvecklingen av plackbildning, vilket är särskilt användbart när man arbetar med ett okänt virus eller replikering kinetik. Vi har emellertid funnit att färgningen är typiskt inte lika distinkt vid användning av neutralrött. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) erbjuder flera fördelar, såsom de gula färgade färgämnes fläckar lever celler mörkblå och virala plack kan räknas utan avlägsnande av överlägget som med neutralrött. Den höga kontrasten mellan levande och döda celler som erbjuds genom MTT medger också detektion av små plack vid en tidigare tidpunkt efter infektion, Även om minne som fortfarande skulle kräva borttagande av överlagringen 8. Som kristallviolett kan enkelt göras i en lösning av vatten och alkohol, och ger en hög grad av känslighet för blandad plackmorfologi har vi valt det som en prioriterad och förenklad motverka fläck för protokollet visade när vi utnyttjar flera familjer av väl karakteriserade virus.
Efter fixering och färgning av infekterade cellmonoskikt, är plack räknades för att titrera virala stock prover i form av plackbildande enheter (pfu) per ml. En logg droppe bör noteras mellan seriespäd och beroende på plåtstorlek, mellan 5-100 plack räknades, med en negativ kontroll används som referens. Statistiskt prov varierar med 10% för varje 100 plack räknas när man jämför prov replikerar 3. Fördelen med att använda plackanalyser för att bestämma virustitrar ligger i deras förmåga att kvantifiera det faktiska antalet infektiösa viruspartiklar wnom provet. Som flera virioner skulle kunna infektera en enda cell, är terminologin enheter kontra vironer används under plack titreringar 1,2.
Plackmorfologi kan variera dramatiskt under olika tillväxtbetingelser och mellan virusarter. Plack storlek, klarhet, definition gränsen, och distribution bör alla noteras eftersom de kan ge värdefull information om de tillväxt- och virulensfaktorer av viruset i fråga.
Grundläggande plack analysprinciper kan även anpassas och modifieras på ett antal olika sätt, till exempel vid användning av fokusbildande analyser (FFAs). FFAs inte lita på cellysering och motfärgning att upptäcka plackbildning, utan snarare använder immunfärgning tekniker för att direkt upptäcka intracellulära virusproteiner genom taggade antikroppar. Ökad känslighet, minskad inkubationstider efter infektion, och framför allt förmågan att kvantifiera icke-lytiska virus är alla distinktafördelar när de anställer FFAs. Medan stor utsträckning, de kritiska begränsande faktorerna i FFAs kontra en traditionell plackanalys ligger i behovet av lämpliga antikroppar och förmåga att endast sond för virala proteinsubenheter versus aktuella infektiösa vironer 4.
För denna studie kommer vi att begränsa vår diskussion till klassiska plackanalyser och beskriver användningen av traditionella fasta och halvfasta över (agaros och CMC), tillsammans med nya flytande mikrokristallin cellulosa överlägg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska faktorn för en framgångsrik plackanalys ligger i optimeringen av protokollet för den speciella virusodling i fråga som villkor kan variera kraftigt. Viktiga punkter att ta hänsyn till är: värd cellulär kompatibilitet med viruset i fråga, lämpliga virala tillväxtförhållanden, tillräckliga utspädnings intervall för att tydligt skilja plack, och korrekt över val och färgning för celler och virus i fråga.
Medan VEEV och RVFV båda växa under mycket likartade förhållanden som använder många av samma typer värdcell, skillnader i plackmorfologi och tillväxt kinetik varierar kraftigt. Vid användning av Vero-celler för plackanalyser, som traditionellt har använts som en förökning och indikator cellinje för hemorragisk febervirus och alfavirus, växer VEEV normalt till högre titrar än RVFV och visar ökad replikering kinetik, utveckla stora enhetliga plack vid 48 hpi 4, ett0-12. I motsats till VEEV kräver RVFV 72 hpi och visar plack som normalt mycket mindre och varierar i storlek.
I opposition till RVFV och VEEV är influensavirus starkt värdcellsspecifika och kan vara svårt att utbreda sig genom vävnadsodling. För influensavirus, är viralt inträde och fusion normalt initieras genom bindning av cellytreceptor med det virala glykoproteinet hamagglutinin (HA), som medierar inträdet i målcellen genom bindning med värdcellens α-sialinsyra ytreceptor. HA är en trimer glykoprotein som är närvarande i membranhölje av alla Influensavirus och kräver klyvning in i subenheterna HA1 och HA2 med en specifik värdcell proteas. För att ytterligare komplicera frågan, kan dessa klyvningsställen varierar ofta mellan virusstammar 13. Som ett uttryck för proteaser kan klyva HA är begränsad till specifika vävnader, proteaser are ofta läggs till cellodlingsmedier för att underlätta viral fusion och inträde i den utvalda värdcellen 13. TPCK-trypsin är ett exempel på ett allmänt använt proteas som används i cellodling med både MDCK och Vero-celler: att underlätta multicykelreplikation (i frånvaro av någon trypsin inaktiveserum) genom proteolytisk aktivering av viralt HA 14,15.
Som visats i denna studie och andra, kan skillnader i virala livscykler påverkar overlay val, tallriksformat och uppsamlingstider, med betydande variationer mellan olika klasser och arter av virus. I vår studie agaros över visade tydligare plack vid högre titrar än både CMC eller flytande överlägg för både RVFV och influensa B-virus, stärka dess användbarhet hos ett brett spektrum av virus och celltyper. Med hjälp av en låg slutlig koncentration av agaros stor nytta i att ta bort de fasta pluggar och förenklad färgning. CMC övergripande visat poorest effektivitet som ett över för alla tre testade virus och producerade mycket små och otydliga plack för influensa B-virus. Även om den totala CMC visade de minst önskvärda egenskaper, dess användning i snabbväxande och mycket virulenta virus skulle kunna visa sig fördelaktigt, eftersom det gjorde verkar kunna minska plackstorleken med endast en minimal minskning i titer. Vätske overlay visade sig vara den mest mångsidiga i att det var mycket enkel att förbereda, ökad användarvänlighet och var jämförbar med agaros över alla de virus som selekterats. I en högre genomströmning 96-brunnars plattformat, applicering och borttagning inhiberades inte på grund av stelning som med traditionella övertäckningar, och förutsatt exakta och konsekventa resultat. En övervägande vid användning av flytande över ligger i opaka färg och oförmåga att övervaka plackbildning eftersom plattorna inte kan flyttas fram till tidpunkten för insamling, begränsar denna anpassning till virus med tidigare karakteriserade replikering kinetik.
<pclass = "jove_content"> Mindre ändringar i plack analysbetingelser kan avsevärt ändra resultatet, samt utvärdering och fullgörande av ett nytt system eller teknik alltid är motiverad. Medan en optimerad och standardiserad plackanalysprotokoll finns inte för varje situation, vår rapport visar mångsidigheten och användarvänlighet i traditionella såväl som nya flytande överlägg för plackanalyser, samtidigt som den ger en tillräcklig bakgrund för ytterligare förändringar på.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
| MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
Referencias
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
