プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

正確にウイルス力価を評価するためのプラークアッセイの能力は、多くの因子に依存する：細胞およびウイルスの生存に適切な宿主細胞の選択、適切な培地および増殖条件、固定化されたウイルスの伝播および別個のための十分な時間を可能にするウイルスの潜伏期間を正確に決定するそして可算プラーク形成。 サンプルタイプが異なる横切っオーバーレイ選択、インキュベーション期間、およびプラーク形態：この研究では、3つの代表的なファミリーからのウイルスは、違いを示すために選択した。ベネズエラウマ脳炎（VEEV）は馬の種およびヒトにおける重大な疾患を引き起こし、トガウイルスファミリーを表しことができ、（+）のssRNAウイルスのモデルとして選ばれました。インフルエンザB台湾株、セグメント化された（ – ）主に人間に感染するのssRNAウイルスは、オルトミクソウイルス科を表します。リフトバレー熱ウイルス（RVFV）、（ – ）主に節足動物に感染するのssRNA節足動物生まれウイルス、反芻動物と人間は、ブニヤウイルス科の代表として選ばれました。 RVFV（ 図1）のために、力価は、72時間後の感染のために並んでインキュベートしたCMC、アガロース、またはアビセルオーバーレイを利用して12ウェルプレートフォーマットにおけるRVFVの組換え生弱毒MP12株のストック溶液から決定した（HPI）。 10 -4から10 -7までの範囲の希釈物CMC及びアガロースオーバーレイを使用して、パネルA.プラークで見られる示す代表的なプレートを、明確に定義された円形の境界線と、小さな明確かつ明瞭なプラークを示した。液体オーバーレイプラークはもう少し豊富アガロースおよびCMCプラークに比べて大きかった、あまり明確な境界線を提供する。ウイルス力価は比較的実行オーバーレイの全てをパネルBに比較した。 reproducを決定するために、より大きなサンプルサイズと共にMP12のためのオーバーレイの中で明確に視覚的な比較を得るためにIBILITYは、6ウェルプレートも、三重（ 図2）でトライアルが行われました。 6ウェルプレート形式で、CMCオーバーレイの使用は、互いに大きさが同程度であったアガロースまたは液体のいずれかのオーバーレイよりも小さいプラークを示した。ウイルス力価は、3つのすべてのオーバーレイ（パネルD）との間で類似していたが、アガロースおよび液体オーバーレイに形成されたプラークは、それらのサイズの増加にカウントするように容易に証明した。 著しく変化した（ 図3A）が異なるオーバーレイの中RVFV、VEEV力価およびプラーク形態とは対照的である。プラークサイズおよび感度（パネルB）を犠牲にして、12ウェルプレートフォーマットを使用した場合CMCオーバーレイに形成されたプラークを明確かつ明瞭な形態を示した。 CMCとは対照的に、アガロースおよび液体オーバーレイの使用は、より低いウイルス阻害及びVEEV複製に対する感受性の増加を示し、有意に大きいプラークをもたらした。もっぱらapに、CMCに対するアガロースを比較した場合これは、以前に確認されたフアレスらによって公表APER。4。アガロースおよび液体オーバーレイがCMCよりも大きいプラークを生成しながら、プラークが不十分境界線を定義し、液体オーバーレイが最大の国境拡散を提供するとともに、12ウェルフォーマットでカウントすることは困難でしたていた。プラークを6ウェルプレート（ 図4）にトライアルが行われた場合には、より大きな6ウェルフォーマットの面でCMCオーバーレイに優れた証明アガロースで、12ウェルフォーマットで区別することが困難であった明白大きなプラークと液体オーバーレイの問題をネゲート敏感にプラーク定義と（ 図4D）。 プラーク形成時RVFVまたはVEEVと比較して、インフルエンザは、外部プロテアーゼの要件として、いくつかのユニークな課題を提供します。アガロースのブランドが異なると同じくらいマイナーな修正がなけれ持っているときに有意の変化が注目されているように、異なるオーバーレイ選択にインフルエンザウイルスの感度もよく、過去に報告されているenが9を使用していました。 興味深いことにインフルエンザB台湾株について、オーバーレイとして、CMCの使用はカウントが困難であったと（ 図5A）、確実に得点することが困難であることがわかっ著しく小さいプラークをもたらした。アガロースオーバーレイの使用は最善のプラーク（パネルC）を提供し、そして（おそらく増加により、単層の生存率への）暗い背景汚れが生じ、液体オーバーレイ（パネルBの使用を直接比較して鮮明でシャープなプラークを示した）。 例えば、アガロースおよびCMCなどの固体及び半固体オーバーレイオーバー液体ポリマーの明確な利点は、除去とアプリケーションの容易さにある。半固体オーバーレイは、加熱を必要とし、取り扱いおよび削除するときに凝固が問題に証明することができます。これらの利点を活用し、RVFVのためのハイスループット様式でアビセルを利用する実用性を決定するために、96ウェルプレートフォーマットは、様々なオーバーレイconcentratiでトライアルが行われたアドオン（ 図6）。 RVFV MP-12の場合、希釈は、アビセルの両方0.6と1.2％の最終濃度で4回行った。レプリケート間または濃度の間に明らかな違いは高い再現性を実証し、指摘しないとオーバーレイ適用および除去は、単純な証明した。得点すると、プラークがRVFVのための高スループットな方法で液体オーバーレイを利用の実現可能性を実証し、肉眼ではっきりと可算だった。 図1：RVFVプラークオーバーレイ比較は12ウェルプレートを利用 Verosを12ウェルプレート中に2.5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈した試料を用いて出発200μlで感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％のCMC（最終Cの1.5ミリリットルオーバーレイoncentrations）、パネルBで計数し、力価測定したパネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用した。 図2：6ウェルプレートを利用しRVFVプラークオーバーレイ比較は Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。パネルACについて記載したようにパネルAに示されているように、0.3％アガロース3mlのオーバーレイ、0.6％アビセル、または1％CMCは、直接オーバーレイを比較するために適用された、BおよびC.個別の実験はして、同じように実施したプラークを計数し、パネルD（N = 3）で力価測定。 図3：<12ウェルプレートを用いて強い> VEEVプラークオーバーレイ比較。Verosは、12ウェルプレート中で2.5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83ワクチン株の同じ段階希釈し、出発試料を用いて200μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 1.5mlのオーバーレイ、パネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたパネルBにカウントし、力価測定した。 図4：V EEVプラークオーバーレイ比較は6ウェルプレートを利用 Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC、3mlのオーバーレイが示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたプラークは、パネルDにおいて計数し、力価測定して、C（N = 3） – パネルAで、BおよびC.個別の実験は、パネルAについて記載した同一のように行った。 図5：インフルエンザプラークオーバーレイ比較 MDCK細胞を6ウェルプレートに5×10 5細胞で播種し、インフルエンザB台湾の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物を400μlに感染させた。 FBSは、ウイルス融合に必要とされる特定のプロテアーゼの阻害を介してインフルエンザの伝播を阻害することができるようになし、ウシ胎児血清（FBS）は、増殖培地またはオーバーレイに使用しなかった。 TPCKトリプシンは、宿主細胞とウイルスの融合および侵入を容易にするために、適用前にオーバーレイのすべてに添加した。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 3mlのオーバーレイを直接比較するために適用されたC、パネルDで計数し、力価測定プラークと（N = 3） – パネルAに記載のようにパネルA、BおよびC.独立した実験で実証されるようにオーバーレイが同一に実施した。平均値は、CMCプラークのために採取されたが、彼らは、拡散境界線と非常に小さいプラークサイズを実証したように、確実にカウントするために困難であることが判明。 図6：。ハイスループットプラークオーバーレイ Verosの96ウェルプレートは、ウェルあたり3×10 4細胞で播種、四重に、1時間RVFV MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物50μlの感染させた。オーバーレイについては、アビセル、0.6および1.2％の最終濃度は、ハイスループット様式、パネルAおよびB内の液体オーバーレイを利用することの実現可能性および再現性を決定するために、トライアルが行われた。。 RVFV VEEV インフルエンザB 細胞型ベロベロ MDCK 感染期間 1時間 1時間 45分インキュベーション時間 3日間 2日 3日間 表1：プラークアッセイ接種条件および細胞型 RVFV VEEV インフルエンザB 細胞型ベロベロ MDCK 成長型 DMEM中1 DMEM中1 DMEM中2 プラークメディア 2xEMEM A 2xEMEM A 2xEMEM B 1.ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシンを補充した。 2.ダルベッコ改変イーグル培地、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシン、0.2％ウシ血清アルブミン、0.025％HEPES、DEAEデキストラン50ugの/ mlを補充した。 5％FBS（25ml）に溶解し、1％の最小必須アミノ酸（5ml）中、1％ピルビン酸ナトリウム（5ml）を、1％のL-グルタミン（5 ml）を補充した2×A.最小必須培地（500ml）に、 2％ペニシリン/ストレプトマイシン（10ml）で。 0.2％ウシ血清アルブミンを補充した2×B.最小必須培地（500ml）を、1％の最小必須アミノ酸（5ml）に、50ugの/ mlの0.025％HEPES、DEAEデキストラン、トリプシンTPCK * *準備の直前には、25あたり1μlを添加するあなたはプラークアガロースと混合するために使用する分量にTPCKトリプシンの2μg/ mlのストック溶液。 表2：プラークおよびウイルス/細胞増殖Medias RVFV VEEV インフルエンザB 細胞型ベロベロ MDCK 感染期間 1時間 1時間 45分インキュベーション時間 3日間 2日 3日間限り無菌性が維持されるように作ったとき、オーバーレイソリューションは期限切れになりません。 表3：オーバーレイ証券 6ウェル 12ウェル 96ウェル細胞の＃/ウェル 5×10 5 2.5×10 5 3×10 4 接種の容量（μL） 400 200 50 オーバーレイの容量（ml） 3 1.5 0.100 表4：プレートフォーマット