Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

La capacidad de los ensayos de placa de evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección de células huésped apropiado, medios y condiciones de crecimiento adecuadas para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizado, y una determinación exacta del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para distinta y la formación de placa contable. Para este estudio, se eligieron tres familias de virus representativos para demostrar diferencias en: la selección de superposición, períodos de incubación, y morfología de la placa a través de diferentes tipos de muestras. La encefalitis equina venezolana (VEEV) fue seleccionado como un modelo viral (+) ARN de cadena simple, que puede causar enfermedad significativa en las especies y seres humanos equinos y representa la familia Togaviridae. Influenza B cepa Taiwán, una segmentado (-) de virus ARN de cadena simple que infecta principalmente los seres humanos, representa a la familia Orthomyxoviridae. Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), a – virus de ARN de cadena simple artrópodo nacido infectando principalmente artrópodos, ()rumiantes y los seres humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), los títulos se determinaron a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada recombinante MP12 de RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando CMC, agarosa, o Avicel superposiciones que se incubaron de lado a lado para después de la infección 72 hr (HPI). Un plato representativo que muestra diluciones que van desde 10 -4-10 -7 se puede ver en el panel A. Las placas utilizando CMC y superposiciones de agarosa mostró placas pequeñas, claras y distintas, con un borde circular bien definida. Las placas con una capa de líquido fueron ligeramente más abundantes y de mayor tamaño en comparación con las placas de agarosa y CMC, y proporcionaron una frontera menos distintas. Los títulos virales se compararon en el Panel B con todas las superposiciones realizar comparable. Con el fin de obtener una comparación visual más clara entre las superposiciones de MP12, junto con un tamaño de muestra mayor para determinar reproduccibilidad, una placa de 6 pocillos también se probó por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeño que cualquiera superposiciones de agarosa o líquidos, que eran comparables en tamaño a la otra. Mientras que los títulos virales fueron similares entre los tres superposiciones (Panel D), placas formadas en las capas de agarosa y líquidos resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño. En contraste con RVFV, los títulos de VEEV y morfología de la placa entre las superposiciones de diferentes variaron notablemente (Figura 3A). Placas formadas en las capas de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utiliza un formato de placa de 12, a expensas de tamaño y sensibilidad de la placa (Panel B). En contraste con CMC, el uso de agarosa y líquidos superposiciones resultó en placas significativamente más grandes, lo que indica la inhibición viral más baja y aumento de la sensibilidad a la replicación VEEV. Esto fue confirmado previamente cuando se comparan exclusivamente agarosa frente a CMC en apaper publicado por Juárez et al. 4. Mientras agarosa y líquidos superposiciones producen placas más grandes que CMC, las placas habían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, con superposiciones de líquidos que proporcionan la mayor difusión frontera. Cuando las placas se probaron en placas de 6 pocillos (Figura 4), ​​el más grande formato de 6 pocillos negada la cuestión de la abiertamente grandes placas que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, con agarosa y superposiciones de líquidos que demuestren superior a las superposiciones de CMC en términos de definición placa y sensibilidad (Figura 4D). En comparación con RVFV o VEEV, influenza proporciona varios desafíos únicos cuando formación de placas, tales como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad de los virus de la influenza a las diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentado en el pasado ya que se han observado cambios significativos cuando las modificaciones de menor importancia como como diferentes marcas de agarosa tienen seres usado 9. Es interesante para la cepa de la influenza B Taiwán, el uso de la CMC como una superposición dio lugar a placas notablemente más pequeños que eran difíciles de contar y resultaron difíciles de marcar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una capa de agarosa proporcionó las mejores placas (Panel C), y resultó en una mancha de fondo más oscuro (probablemente debido a un aumento de la viabilidad monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición de líquido (Panel B ). Una clara ventaja de polímeros líquidos más de superposiciones sólidas y semisólidas, tales como agarosa y CMC, se encuentra en la facilidad de eliminación y aplicación. Superposiciones semiduros requieren calefacción, y la solidificación puede ser problemático cuando la manipulación y eliminación. Con el fin de sacar provecho de estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en forma de alto rendimiento para RVFV, un formato de placa de 96 pocillos se probó en diferentes concentrati superposicióncomplementos (Figura 6). Para RVFV MP-12, las diluciones se realizaron por cuadruplicado en ambos 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel. Aplicación de superposición y la eliminación demostraron simple, sin diferencias aparentes entre repeticiones o entre las concentraciones observadas, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintos y contable a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de la utilización de superposiciones de líquidos en un alto rendimiento para RVFV manera. Figura 1: Placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron a Veros 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC (c definitivaoncentrations), se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostrado en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. Figura 2: placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Tres ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A, B, y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe para paneles de AC, con las placas se contaron y se titularon en el Panel D (N = 3). Figura 3: <strong> placa VEEV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron Veros. a 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l utilizando la misma muestra diluido en serie a partir de la cepa de la vacuna VEEV TC-83. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. Figura 4: V EEV comparaciones de superposición de la placa que utilizan placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de VEEV TC-83.. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostradoen los Paneles A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica a la descrita para Paneles A – C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Figura 5: INFLUENZA placa comparaciones de superposición de las células MDCK se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de Influenza B Taiwan.. No suero bovino fetal (FBS) se utilizó en el medio de crecimiento o superposiciones, como FBS puede inhibir la propagación de la influenza mediante la inhibición de ciertas proteasas que son necesarios para la fusión viral. TPCK-tripsina se añadió a todas las superposiciones antes de la aplicación con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada con las células huésped. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC se aplicaron con el fin de comparar directamentelas superposiciones como se demuestra en el Panel A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe en los Paneles A – C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Mientras que en promedio fue tomada por placas CMC que resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que demostraron fronteras difusas y tamaños muy pequeños de placa. Figura 6:. Superposiciones de placa de alto rendimiento Una placa de 96 pocillos de Veros en placas a 3 x 10 4 células por pocillo, se infectaron con 50 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones de líquidos de una manera de alto rendimiento, paneles A y B. RVFV VEEV Influenza B Tipo de la célula Vero Vero MDCK Período de infección 1 hora 1 hora 45 min El tiempo de incubación 3 días 2 días 3 días Tabla 1: La placa de ensayo de inoculación condiciones y tipos de células RVFV VEEV Influenza B Tipo de la célula Vero Vero MDCK Tipo de crecimiento DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2 Placa de Medios Un 2xEMEM Un 2xEMEM 2xEMEM B 1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina. 2. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina, 0,2% albúmina de suero bovino, HEPES 0,025%, DEAE-dextrano 50 ug / ml. A. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con FBS al 5% (25 ml), 1% Esencial Mínimo Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato sódico (5 ml), 1% de L-glutamina (5 ml), 2% penicilina / estreptomicina (10 ml). B. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino, aminoácidos esenciales 1% mínimo (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextrano, Tripsina-TPCK * * Justo antes de la preparación, añadir 1 l por cada 25ml de 2 mg / ml de tripsina-TPCK a la alícuota que va a utilizar para mezclar con agarosa para placas. Tabla 2: La placa y Viral / Celular Crecimiento Medios RVFV VEEV Influenza B Tipo de la célula Vero Vero MDCK Período de infección 1 hora 1 hora 45 min El tiempo de incubación 3 días 2 días 3 días Soluciones de superposición no expirarán cuando se hace siempre y cuando se mantenga la esterilidad. Tabla 3: Superposiciones Stock 6 así 12 así 96 así Nº de células / pocillo 5 x 10 5 2,5 x 10 5 3 x 10 4 Volumen de inóculo (l) 400 200 50 volumen de superposición (ml) 3 1.5 0,100 Tabla 4: Formatos de placas