Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Die Fähigkeit von Plaque-Assays, genau zu beurteilen Virustiter beruht auf zahlreichen Faktoren: geeignete Wirtszelle Auswahl geeigneten Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit immobilisierten Virusausbreitung und eine genaue Bestimmung des viralen Inkubationszeit, um eine angemessene Zeit für verschiedene ermöglichen und zählbare Plaquebildung. Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien gewählt, um Unterschiede in der zeigen: Overlay-Auswahl, Inkubationszeiten und Plaquemorphologie in unterschiedlichen Probenarten. Venezolanischen Pferde-Enzephalitis (VEEV) wurde als (+) ssRNA Virusmodell, das bedeutende Krankheit bei Equiden und Menschen verursachen und stellt die Familie Togaviridae ausgewählt. Influenza B Taiwan Stamm, einem segmentierten (-) ssRNA-Virus vor allem Menschen infizieren, stellt die Familie Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein (-) ssRNA Arthropoden geboren Virus primär infizieren Arthropoden,Wiederkäuer und Menschen wurde als Vertreter der Familie Bunyaviridae ausgewählt. Für RVFV (Figur 1), wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten lebenden attenuierten Stamm von MP12 RVFV in einer 12-Well-Plattenformat unter Verwendung CMC, Agarose oder Avicel Overlays, die Seite-an-Seite für 72 Stunden nach der Infektion inkubiert wurden bestimmt (hpi). Ein Vertreter Schild mit Verdünnungen im Bereich von 10 -4 bis 10 -7 in Feld A. Plaques mit CMC zu sehen und Agarose Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten Kreisgrenze. Plaques mit einer Flüssigkeit Overlay waren etwas reichlicher und im Vergleich zu Agarose und CMC Plaques größer, und lieferte eine weniger deutliche Grenze. Virustiter wurden in Tafel B mit allen Überlagerungen vergleichsweise Führen verglichen. Um eine klarere visuelle Vergleich zwischen Overlays für MP12 zusammen mit einer größeren Stichprobenumfang zu bestimmen Reproduk erhaltenbilität wurde eine 6-Well-Platte auch in dreifacher Ausführung (Abbildung 2) erprobt. In der 6-Well-Plattenformat, die Verwendung eines CMC-Overlay zeigten kleinere Plaques als entweder Agarose oder Flüssigkeitsüberlagerungen, die in der Größe miteinander vergleichbar waren. Während virale Titer waren ähnlich zwischen allen drei Überlagerungen (Tafel D), erwies sich Plaques in Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen gebildet leichter zu zählen wegen ihrer erhöhten Größe. Im Gegensatz RVFV, VEEV Titer und Plaquemorphologie zwischen den unterschiedlichen Überlagerungen stark variiert (3A). Plaques in CMC Overlays gebildet zeigte eine klare und deutliche Morphologie bei Verwendung einer 12-Well-Plattenformat, auf Kosten der Plaquegröße und Empfindlichkeit (Feld B). Im Gegensatz zu CMC, die Verwendung von Agarose und flüssigen Überlagerungen zu einer signifikant größeren Plaques, was geringere Virushemmung und erhöhte Empfindlichkeit gegen VEEV Replikation. Dieser wurde zuvor bestätigt, als allein zu vergleichen Agarose gegen CMC in apaper veröffentlicht von Juarez et al. 4. Während Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen erzeugt größere Plaques als CMC hatten die Plaques schlecht definierten Grenzen und waren schwierig, in einem 12-Well-Format zählen, mit flüssigem Overlays Erbringen der größten Grenzdiffusion. Wenn Plaques wurden in 6-Well-Platten (Abbildung 4) erprobt, negiert die größeren 6-Well-Format das Thema offenkundig großen Plaques, die schwer in der 12-Well-Format zu unterscheiden waren, mit Agarose und flüssigen Overlays beweisen besser als die CMC-Overlays in Bezug auf Plaque Definition und sensibel (4D). Im Vergleich zu RVFV oder VEEV bietet einige einzigartige Herausforderungen Influenza bei Plaquebildungs, wie das Erfordernis einer externen Protease. Die Empfindlichkeit des Influenza-Virus zu unterschiedlichen Overlay Auswahl wurde auch in der Vergangenheit gut dokumentiert als signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn Änderungen so gering wie unterschiedliche Marken aus Agarose habenen verwendet 9. Interessant für das Influenza-B-Stamm Taiwan, die Verwendung von CMC als Overlay Folge deutlich kleinere Plaques, die schwer zu zählen sind, und erwies sich als schwierig, zuverlässig Note (5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlay versehen die besten Plaques (Feld C) und ergab einen dunkleren Hintergrund-Färbung (wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Mono Lebensfähigkeit) und zeigte deutlicher und schärfer Plaques im direkten Vergleich zu der Verwendung des Flüssigkeitsüberlagerung (Feld B ). Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren auf festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der Leichtigkeit der Entfernung und Anwendung. Halbfesten Overlays erfordern Heizung und Verfestigung kann problematisch erweisen bei der Handhabung und Beseitigung. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität der Verwendung von Avicel in einem Hochdurchsatz Weise RVFV zu bestimmen, wurde eine 96-Well-Platte-Format bei unterschiedlichen Lagerungs concentrati trialedons (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden in vierfacher Verdünnungen an beiden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel geführt. Overlay Anwendung und Entfernung erwies sich als einfach, ohne erkennbare Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen Konzentrationen festgestellt, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit. Beim Vertonen waren Plaques deutliche und zählbaren mit dem bloßen Auge, die Machbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurch Weise RVFV. Fig. 1: RVFV Plaque Overlay Vergleiche unter Verwendung 12-Well-Platten wurden bei Veros 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC (c endgültigenoncentrations) wurden um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert. Fig. 2: RVFV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie in Panel A gezeigt, wurden B und C. Separate Experimente identisch durchgeführt wie für Panels AC beschrieben mit Plaques gezählt und in Feld D (N = 3) titriert. Figur 3: <strong> VEEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 12 Vertiefungen. Veros wurden bei 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstoff-Stamm infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert Fig. 4: V EEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder eine 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet als nachgewiesenin den Feldern A, B und C wurden Separate Experimente identisch durchgeführt wie bei den Feldern A beschrieben – C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Figur 5: Influenza Plaque Overlay Vergleiche MDCK-Zellen wurden mit 5 x 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von Influenza B Taiwan infiziert.. Kein fötales Rinderserum (FBS) wurde in das Wachstumsmedium oder Überlagerungen verwendet werden, wie FBS kann Influenza Ausbreitung durch Inhibition von bestimmten Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich hemmen. TPCK-Trypsin, um virale Fusion und die Eingabe mit den Wirtszellen zu erleichtern, um alle Überlagerungen vor der Anwendung hinzugefügt. Nach der Infektion wurden 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC, um direkt zu vergleichen angewendetdie Symbole wie in Panel A, B und C. Getrennte Experimente zeigten, wurden identisch durchgeführt wie in Panel A beschrieben – C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Während ein durchschnittlicher wurde für CMC Plaques ergriffen sie erwies sich als schwierig, um zuverlässig zu zählen, wie sie diffuse Grenzen und sehr kleine Plakette Größen demonstriert. Fig. 6: Hochdurch Plaque Overlays Eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert der Veros bei 3 x 10 4 Zellen pro Well wurden mit 50 & mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe RVFV MP12 für 1 Stunde infiziert, in vierfacher Ausfertigung. Für die Überlagerungen wurden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurchsatz-Weise Panels A und B zu bestimmen erprobt. RVFV VEEV Influenza B Zelltyp Vero Vero MDCK Infektionsperiode 1 Stunde 1 Stunde 45 min Inkubationszeit 3 Tage 2 Tage 3 Tage Tabelle 1: Plaque-Assay Inokulation Bedingungen und Zelltypen RVFV VEEV Influenza B Zellen-Art Vero Vero MDCK Wachstumstyp DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2 Plaque Medien 2xEMEM A 2xEMEM A 2xEMEM B 1. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin ergänzt. 2. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml ergänzt. A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% Natriumpyruvat (5 ml), 1% L-Glutamin (5 ml) ergänzt, 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 0,2% Rinderserumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK ergänzt * * Kurz vor der Zubereitung, fügen 1 ul pro 25ml 2 ug / ml Bestand TPCK-Trypsin zu dem aliquoten Sie verwenden werden, um mit Agarose für Plaques mischen. Tabelle 2: Plaque und Viral / Zellwachstum Medias RVFV VEEV Influenza B Zelltyp Vero Vero MDCK Infektionsperiode 1 Stunde 1 Stunde 45 min Inkubationszeit 3 Tage 2 Tage 3 Tage Overlay-Lösungen wird nicht erlöschen, wenn gemacht, so lange, wie die Sterilität erhalten bleibt. Tabelle 3: Overlays Lizenz 6 gut 12 gut 96 gut Anzahl der Zellen / Vertiefung 5 x 10 5 2,5 x 10 5 3 x 10 4 Volumen Innokulum (ul) 400 200 50 Volumen von Overlay (ml) 3 1,5 0,100 Tabelle 4: Plattenformate