تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية
Summary
Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Abstract
تبقى المقايسات البلاك إحدى الطرق الأكثر دقة لتقدير المباشر لvirons المعدية والمواد المضادة للفيروسات من خلال عد لويحات منفصلة (الوحدات المعدية والمناطق الميتة الخلوية) في زراعة الخلايا. نحن هنا لشرح كيفية إجراء فحص اللوحة الأساسية، وكيفية تراكب وأساليب متباينة يمكن أن تؤثر على تكوين البلاك والإنتاج. عادة ركائز صلبة أو نصف صلبة تراكب، مثل الاغاروز أو كاربوكسيميثيل السليلوز، وقد استخدمت لتقييد انتشار الفيروس ومنع العدوى من خلال العشوائي وسط النمو السائل. تراكب يجمد تقيد العدوى الخلوي لأحادي الطبقة المحيطة بها فورا، والسماح للتشكيل بؤر معدود منفصل وتشكيل لوحة لاحق. للتغلب على الصعوبات الكامنة في استخدام تراكب التقليدية، تراكب السائل رواية باستخدام السليلوز الجريزوفولفين والسليلوز carboxymethyl الصوديوم قد استخدمت على نحو متزايد كبديل في مستوىفحص اللوحة. السائلة المقايسات لوحة تراكب يمكن أن يؤديها بسهولة في أي معيار 6 أو 12 صيغ لوحة كذلك في الأساليب التقليدية، ويتطلب أي معدات خاصة. نظرا إلى حالته السائلة وسهولة اللاحقة من تطبيق وإزالتها، يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم صيغ لوحة ثقافة صغرى كبديل الإنتاجية سريع ودقيق ورفيع إلى المعايرة الفيروسية نطاق أوسع. استخدام السائل اللزج ساخنة البوليمر عدم توفر الفرصة لتبسيط العمل، وتحافظ على الكواشف، الفضاء الحاضنة، وزيادة السلامة التشغيلية عند استخدامها في مختبرات الاحتواء التقليدية أو عالية كما لا التدفئة كاشف أو الأواني الزجاجية مطلوبة. تراكب السائلة قد تكون أيضا أكثر حساسية من تراكب التقليدية للحرارة بعض الفيروسات عطوب.
Introduction
وقد تم عزل دقيقة والكمي للعينات فيروسية قابلة للحياة على الدوام هدفا البحوث الجارية في علم الفيروسات. لم يكن حتى مجيء فحص اللوحة في عام 1952 أن وسيلة للكميا ونوعيا حساب التتر الفيروسية الحيوانية وقد تم تطوير أول 1،2. وقد تم تكييف هذه التقنية لأول مرة وتعديلها من المقايسات فج، والتي سبق استخدامها لحساب التتر من البكتيريا الأسهم في بيولوجيا النبات 1،2. في حين أن وسائل بديلة للالكمي الفيروسي ومنذ ذلك الحين تم تطويرها وتكييفها، مثل المناعية، ومضان المجهر الإلكتروني انتقال، الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني)، التدفق الخلوي، وأنظمة مراسل المؤتلف، والعكس الكمي سلسلة البوليميراز رد فعل النسخ (QRT-PCR) ، تفشل هذه الأساليب لتحديد وquantitate تكرار virons المختصة 1،3. بينما تستمر التقدم في التكنولوجيات والتقنيات لتحسين وتغيير المناظر الطبيعية؛ plaquتستمر المقايسات البريد لتمثيل معيار الذهب في تحديد تركيزات الفيروسية المعدية للvirons التحللي 1،4.
خلال فحص اللوحة، مصاب أحادي الطبقة متموجة من الخلايا المضيفة مع فيروس التحللي من تركيز معروف الذي تم تخفيفه بشكل متسلسل لمجموعة معدود، وعادة ما بين 5-100 virions. ثم يتم تغطية الطبقات الوحيدة المصابة مع وسيلة تراكب مستوقف لمنع العدوى من الانتشار الفيروسي بشكل عشوائي إما من خلال تدفق الميكانيكية أو التضاريسية للوسط السائل خلال انتشار الفيروس. في حين تراكب صلبة أو نصف صلبة مثل الاغاروز، السليلوز الميثيل أو كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) وقد جرت العادة على استخدامها، أصبحت تراكب السائل بديلا جذابا بشكل متزايد مع تطور تراكب سائل جديدة مثل Avicel 5- 7. المقايسات البلاك باستخدام السائل مقابل تراكب التقليدية تتمتع بالعديد من المزايا مثل تراكب يمكن أن يكون تطبيق ورقةالعبوات الناسفة في درجة حرارة الغرفة، وتطبيق وإزالة أسهل بكثير. كما تراكب السائلة لا تحتاج الاحترار، قد الفيروسات عطوب الحرارة حساسة ويثبت أيضا أسهل لوحة.
بعد الإصابة الأولية وتطبيق تراكب مستوقف، لويحات الفردية، أو مناطق من موت الخلايا، سوف تبدأ في تطوير مقيدة عدوى فيروسية كما والتكرار إلى أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف تستمر الخلايا المصابة دورة النسخ المتماثل تحلل العدوى، مما يضخم العدوى، مما أدى لويحات متزايد متميزة ومنفصلة. اعتمادا على حركية النمو والخلايا الفيروسية المضيف المستخدمة، وتشكل لوحة مرئية عادة في غضون 2-14 أيام. يمكن بعد ذلك عد الطبقات الوحيدة الخلوية مع المجهر حقل مشرق القياسية، أو أكثر عادة ثابتة و counterstained بواسطة محايدة أحمر أو الكريستال العنيف من أجل تحديد بسهولة لويحات بالعين المجردة. هناك طائفة واسعة من البقع مكافحة البلاك المتاحة، كل تقدم والعشرينمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو مزايا وعيوب محددة. وعادة ما يضاف الكريستال البنفسجي عند نقطة جمع وبعد تثبيت / إزالة تراكب، وتوفير وصمة عار المضادة السريعة والمتميزة التي تسمح بتحديد لويحات صغيرة جدا عندما التشكل المختلط الحالي. محايد الأحمر في الاستفادة من التطبيق المبكر واتصال دائم مع تراكب، والسماح للرصد المباشر لوضع تشكيل اللوحة، والتي هي مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الفيروس أو النسخ غير معروفة حركية. ومع ذلك فقد وجدنا أن تلطيخ عادة لا متميز كما عند استخدام أحمر محايد. 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) نتروبلو بروميد -2،5-ثنائي الفينيل (الإنتقالي العسكري) ويقدم العديد من المزايا، مثل البقع الصفراء الصبغة الملونة خلايا يمكن الاعتماد ويحات زرقاء داكنة والفيروسية دون إزالة التراكب مثلما يعيش مع أحمر محايد. التباين الكبير بين الخلايا الحية والميتة التي يوفرها الإنتقالي العسكري أيضا يسمح للكشف عن لويحات صغيرة في وقت سابق إصابة آخر نقطة، على الرغم من أن التخزين لا تزال تتطلب إزالة تراكب 8. كما وضوح الشمس فوق البنفسجية يمكن أن يتم ببساطة في محلول من الماء والكحول، ويوفر درجة عالية من الحساسية لوحة التشكل مختلطة، اخترنا أنها مضادة المفضلة ومبسطة وصمة عار لبروتوكول تظاهر لأننا باستخدام عدة عائلات جيدا ومن أهم خصائص فيروسات.
بعد تحديد وتلطيخ أحادي الطبقة الخلوية المصابة، يتم عدها لويحات من أجل عيار العينات الفيروسية الأسهم من حيث تشكيل وحدات لوحة (PFU) في الملليمتر الواحد. وتجدر الإشارة إلى انخفاض سجل بين التخفيفات التسلسلية و، اعتمادا على حجم لوحة، بين 5-100 لويحات عدها، مع سيطرة سلبية استخدامها كمرجع. وتختلف عينات إحصائية بنسبة 10٪ لكل 100 ويحات تحسب عند مقارنة عينة يعيد 3. ميزة استخدام المقايسات لوحة لتحديد التتر الفيروسية تكمن في قدرتها ل quantitate العدد الفعلي من الجسيمات الفيروسية المعدية ثithin العينة. كما virions متعددة يحتمل أن تصيب خلية واحدة، يتم استخدام المصطلحات الوحدات مقابل virons خلال المعايرة البلاك 1،2.
مورفولوجيا الترسبات يمكن أن تختلف بشكل كبير في ظل اختلاف ظروف النمو وبين الأنواع الفيروسية. وتجدر الإشارة إلى حجم كل لوحة، الوضوح، تعريف الحدود، والتوزيع لأنها يمكن أن توفر معلومات قيمة عن النمو وعوامل الفوعة للفيروس في السؤال.
ويمكن أيضا المبادئ الأساسية فحص اللوحة تكييفها وتعديلها في عدد من الطرق المختلفة، مثل استخدام التركيز تشكيل المقايسات (FFAs). FFAs لا تعتمد على تحلل الخلايا وcounterstaining للكشف عن تشكيل لوحة، وإنما توظف تقنيات للكشف عن البروتينات الفيروسية داخل الخلايا مباشرة من خلال الأجسام المضادة المناعية ذات الكلمات الدلالية. زيادة الحساسية، وانخفضت مرة الحضانة بعد الإصابة، والأهم من ذلك القدرة ل quantitate الفيروسات غير التحللي كلها متميزةمزايا عندما توظف FFAs. في حين تستخدم على نطاق واسع، فإن العوامل التي تحد حاسمة في FFAs مقابل فحص اللوحة التقليدية تكمن في الحاجة إلى الأجسام المضادة المناسبة والقدرة على تحقيق الوحيد للمفارز البروتين الفيروسية المعدية الفعلية مقابل virons 4.
لغرض هذه الدراسة، فإننا سوف تحد من مناقشتنا لفحوصات وحة الكلاسيكية ووصف استخدام أغطية صلبة ونصف صلبة التقليدية (الاغاروز وCMC)، جنبا إلى جنب مع رواية الجريزوفولفين السائل تراكب السليلوز.
Protocol
Representative Results
Discussion
العامل الأكثر أهمية لفحص اللوحة الناجح يكمن في تعظيم الاستفادة من بروتوكول للثقافة فيروسية معينة في السؤال عن الظروف يمكن أن تختلف بشكل كبير. النقاط الرئيسية لتأخذ في الاعتبار هي: استضافة التوافق الخلوي مع الفيروس في السؤال، وظروف النمو المناسبة الفيروسية، نطاقات تخفيف كافية من أجل التفريق بوضوح لويحات، واختيار تراكب الصحيحة وتلطيخ للخلايا وفيروس المعنية.
بينما VEEV وRVFV كلا تنمو في ظل ظروف مشابهة جدا استخدام العديد من نفس أنواع الخلايا المضيفة، والاختلافات في البلاك التشكل والنمو حركية تختلف بشكل كبير. عند استخدام خلايا فيرو لفحوصات لوحة، والتي جرت العادة على استخدامها كخط خلية نشر ومؤشر للحمى النزفية الفيروسات وalphaviruses، VEEV ينمو عادة إلى التتر أعلى من RVFV ويوضح زيادة حركية تكرار وتطوير لويحات كبيرة موحدة في 48 HPI 4، 10-12. وعلى النقيض من VEEV، يتطلب RVFV 72 HPI ويبين اللوحات التي عادة ما تكون أصغر بكثير في الحجم ومتغير.
في المعارضة لRVFV وVEEV، فيروس الانفلونزا هو غاية الخلية المضيفة محددة، ويمكن أن يكون من الصعب نشر من خلال زراعة الأنسجة. لفيروس الإنفلونزا، وبدأ دخول الفيروس والانصهار عادة عن طريق ربط مستقبلات سطح الخلية التي تحتوي على بروتين سكري hamagglutinin الفيروسية (HA)، التي تتوسط الدخول إلى الخلية المستهدفة من خلال الربط مع α اللعابي مستقبلات حمض سطح الخلية المضيفة. ها هو بروتين سكري مثلوثي التي هي موجودة في الغشاء المغلف للجميع فيروسات الأنفلونزا ويتطلب الانقسام في HA1 مفارز وHA2 من قبل البروتيني الخلية المضيفة محددة. لمزيد من تعقيد المسألة، يمكن لهذه المواقع انشقاق في كثير من الأحيان تختلف بين سلالات فيروسية 13. كتعبير عن البروتياز القادرة على الشق HA يقتصر على أنسجة معينة، البروتياز عه غالبا ما تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية من أجل تسهيل اندماج فيروسي ودخول الخلية المضيفة اختيار 13. TPCK-التربسين هو مثال واحد من البروتيني المستخدمة عادة يستخدم في زراعة الخلايا مع كل MDCK وخلايا فيرو: تسهيل النسخ المتعددة دورة (في غياب أي التربسين تعطيل المصل) من خلال تنشيط بروتين من فيروس HA 14،15.
كما هو موضح في هذه الدراسة وغيرها، يمكن أن الاختلافات في دورات الحياة الفيروسية تؤثر اختيارات تراكب، صيغ لوحة، وأوقات جمع، مع الفروق الكبيرة بين الطبقات المختلفة وأنواع من الفيروسات. في دراستنا، أظهرت تراكب الاغاروز ويحات أكثر وضوحا في التتر أعلى من أي CMC أو تراكب السائلة لكلا RVFV وفيروس الأنفلونزا B، يعزز فائدتها من بين مجموعة واسعة من الفيروسات وأنواع الخلايا. باستخدام تركيز النهائي انخفاض الاغاروز ساعد الى حد كبير في إزالة شمعات الصلبة وتلطيخ مبسط. أظهرت CMC عموما عoorest فعالية كإضافة لجميع الفيروسات الثلاثة اختبارها وإنتاجها لويحات صغيرة جدا وغير واضحة لفيروس الأنفلونزا (ب). على الرغم من أن مجمل CMC أثبت أقل الخصائص المرغوبة، واستخدامه في النمو السريع للغاية وفيروسات خبيثة قد تثبت فائدة، كما فعلت يبدو لتقليل حجم الترسبات مع وجود انخفاض في الحد الأدنى من عيار. أثبت تراكب السائل أن تكون أكثر تنوعا من حيث أنها كانت بسيطة للغاية لإعداد، وزيادة سهولة الاستخدام، وكان تعادل الاغاروز عبر كافة الفيروسات المحدد. في شكل لوحة إنتاجية أعلى 96 بئرا، وتطبيق وإزالتها لم يكن مستعمل بسبب التصلب كما هو الحال مع تراكب التقليدية، وتقدم نتائج دقيقة ومتسقة. وهناك اعتبار عند استخدام تراكب السائلة يكمن في التلوين مبهمة وعدم القدرة على مراقبة تشكيل لوحة لا يمكن أن يتم نقل الصفائح حتى نقطة جمع، مما يحد هذا التكيف للفيروسات مع حركية تكرار تتميز سابقا.
<pالطبقة = "jove_content"> تعديلات طفيفة في ظروف فحص اللوحة يمكن أن يغير بشكل كبير على النتائج، وهناك ما يبرر دائما تقييم وأداء أي نظام جديد أو تقنية. في حين لا وجود بروتوكول فحص اللوحة الأمثل وموحد لكل حالة، تقريرنا يظهر براعة وسهولة الاستخدام في التقليدية، فضلا عن تراكب سائل جديدة لفحوصات لوحة، في الوقت الذي توفر خلفية كافية لمزيد من التعديلات المستخدم.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
| MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
Referencias
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
