Overview
このビデオでは、マウス乳腺のダクトに注入ミックスを送達する、内帰注入技術について説明します。
Protocol
1. 内管内注射
- 外科処置を通して無菌の技術を使用する。
- 2つの第4のインギナルMGsの間の〜1cmの長さで皮膚の切開部位を作る(図1)。乳腺管の木を視覚化するように、皮膚フラップ(MG)を頭頂部腹膜から慎重に分離します。
- 慎重にウォッチメーカーの鉗子で乳首を保持し、マイクロ解剖はさみを使用して、近くの皮膚を切断することなく、外装乳首を取り外します。
- 33 Gの金属ハブニードルを取り付けた25 μLハミルトンシリンジにAd-Cre注入混合物の負荷は3〜5 μL。注射器中の注入混合物の体積を、混合物に含まれる青色染料に基づいて推定する。
注: 3~4週齢の雌のMGに注入する場合は、より小さい容積(例えば3μL)を使用し、授乳中の雌のMGに注入する場合は、より大きな体積(例えば、10μL)を使用してください。 - 細かい湾曲したトゥイザーで皮膚フラップの端を静かに保持し、乳首にゆっくりとAd-Cre注入混合物を注入し、一方で乳腺管状の木に青い染料の広がりを監視します。ダクタルーメンの損傷を避けるために、射出速度をできるだけ低くしてください。
注: 間質コンパートメントに漏れることなく管全体に広がる注入された流体(含まれているブロモフェノール青色素によって示されるように)は、正常な内管内注入を示す。 - 注射液の漏れを避けるために、乳首から針をそっと引き出します。
- MGまたは注入された乳首の周囲の領域の遠位側(すなわち、乳首から離れている)を調べる。なお、青色染料の膨潤(すなわち、染色が近くの間質に拡散する)は、乳腺脂肪パッド注射ではなく、乳腺脂肪パッド注射を成功させたことを示している。
- 皮膚の外科的創傷(1.2から)を傷クリップで閉じます。
2. 術後ケア
- 麻酔からマウスを取り出し、回復のためにきれいなケージの中の加熱パッドの上に置きます。
- 術後24時間、再び5mg/kgで皮下にメロキシカムを投与する。
- 動物の一般的な状態を監視し、5日間の切開部位で感染の兆候を探します。
- 創傷クリップは手術後7~10日で除去されます。
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Representative Results
図1:MGへのAd-Creウイルスの誘導内注入の概略図。(A) 2つの4番目のMGs(B)青い色素を用いたAd-Creのインタクタル注入(より良い視覚化のために)第4のMGの1つ(C)創傷クリップによる皮膚の切開の閉鎖の間の正中線の切開部位
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 |