Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.
Die zweidimensionale Neutral/Neutral-Gelelektrophorese (2DGE) hat sich als Benchmark-Technik zur Analyse der DNA-Replikation durch natürliche Impedimente herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Progression der Replikationsgabel durch strukturanfällige, expandierbare DNA-Wiederholungen innerhalb des auf dem Affenvirus 40 (SV40) basierenden Episoms in menschlichen Zellen analysiert werden kann. Kurz gesagt, bei der Plasmidtransfektion in menschliche Zellen werden Replikationszwischenprodukte durch das modifizierte Hirt-Protokoll isoliert und mit dem DpnI-Restriktionsenzym behandelt, um nicht-replizierte DNA zu entfernen. Zwischenprodukte werden dann von geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um die Wiederholung des Interesses in der ursprungsdistalen Hälfte eines 3-5 kb langen DNA-Fragments zu platzieren. Die Replikationszwischenprodukte werden in zwei senkrechte Dimensionen unterteilt, zunächst nach Größe und dann nach Form. Nach der Southern-Blot-Hybridisierung ermöglicht dieser Ansatz den Forschern, das Abwürgen der Gabel bei verschiedenen strukturbildenden Wiederholungen in der absteigenden Hälfte des Replikations-Y-Bogens zu beobachten. Darüber hinaus ermöglicht diese Positionierung des Strömungsabrisses die Visualisierung verschiedener Ergebnisse des wiederholt vermittelten Gabelabwürgens, wie z. B. die Gabelumkehr, das Aufkommen einer konvergierenden Gabel und den rekombinatorischen Gabelneustart.
Short Tandem Repeats (STR) sind kleine, typischerweise 2-9 Basenpaare (bp), sich wiederholende DNA-Sequenzen, die etwa 3 % des menschlichen Genoms ausmachen1. STR spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation2; ihre repetitive Zusammensetzung macht sie jedoch anfällig für die Bildung nicht-kanonischer DNA-Sekundärstrukturen und die anschließende genetische Instabilität 3,4. Von linkshändigen Helices über Haarnadeln/Kreuzformen bis hin zu drei- und viersträngigen Helices stellen diese alternativen DNA-Strukturen intrinsische Herausforderungen für das Replisom dar. Eine natürliche Voraussetzung für die Bildung von Sekundärstrukturen ist die DNA-Abwicklung, die eine Voraussetzung für die DNA-Replikation ist. Dies stellt ein einzigartiges Rätsel für die Funktion des Genoms dar, da sich viele dieser Strukturen während der Replikation bilden können, was das Fortschreiten des Replizosoms behindert und letztendlich zum Stillstand der Replikationsgabelführt 5,6,7 oder in schweren Fällen zum Kollaps der Gabel und zum DNA-Bruch 8,9. Es wurde gezeigt, dass sowohl der Neustart von blockierten Gabeln als auch DNA-Reparaturwege zu wiederholter Instabilität führen, wie z. B. wiederholte Expansionen10,11 und komplexe Genomumlagerungen (CGR)12,13. Diese Ereignisse können zur Entwicklung von etwa 60 menschlichen Krankheiten führen, die als wiederholte Expansionsstörungen bekannt sind, darunter das Fragile-X-Syndrom, die Huntington-Krankheit, die Friedreich-Ataxie und andere14,15 sowie CGR-Erkrankungen wie das Emmanuel-Syndrom16. Um die Mechanismen menschlicher Krankheiten, die durch Wiederholungsinstabilität verursacht werden, besser zu verstehen, ist es daher unerlässlich, die Details der Progression der Replikationsgabel durch diese Wiederholungen zu untersuchen.
Mitte der 1980er Jahre entstand eine Technik zur Untersuchung des Replikationsverlaufs, als Brewer und Fangman versuchten, einen direkten Beweis dafür zu erbringen, dass die Replikationsinitiierung bei Saccharomyces cerevisiae an Elementen der autonomen Replikationssequenz (allgemein bekannt als ARS) stattfindet17. Dabei trennten sie die Strukturen von Hefereplikationszwischenprodukten in Agarose und adaptierten damit eine frühere Methode von Bell und Byers, die als 2-dimensionale Neutral/Neutral-Gelelektrophorese (2DGE)18 bekannt ist. Diese Technik nutzte die Tatsache, dass sich nichtlineare DNA in Agarosegel anders bewegt als ihr lineares Äquivalent der gleichen Masse. Genauer gesagt wird bei der 2DGE die isolierte DNA in zwei senkrechte Dimensionen getrennt, zunächst primär nach Größe und dann primär nach Form, um eine umfassende Karte der Replikation in einer bestimmten Region von Interesse zu erstellen. In ihrer ursprünglichen Arbeit zeigten Brewer und Fangman dies als einen Bogen, der aus “einfachen Y”-Strukturen oder Replikationsgabeln besteht, die nicht replizierte DNA mit ihren replizierten Gegenstücken verbinden. Sie beschreiben andere beobachtete Zwischenprodukte als “Blasen” und “doppelte Ys”, die jeweils Replikationsursprünge und konvergierende Gabeln darstellen.
2DGE kann verwendet werden, um die relativen Populationen von DNA-Replikationszwischenprodukten zu einem bestimmten Zeitpunkt zu untersuchen. Wenn also eine Population von Zwischenstufen häufiger vorkommt als eine andere, würde dies bei der Visualisierung offensichtlich sein. Dies macht 2DGE zu einem besonders nützlichen Werkzeug für die Untersuchung des Replikationsfortschritts durch anspruchsvolle Sequenzen, wie z. B. strukturbildende Wiederholungen. Wenn die analysierte Region beispielsweise eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, einen Strömungsabriss der Replikationsgabel zu induzieren, würde dies als Ausbuchtung auf dem Bogen dargestellt werden (Abbildung 1A), was auf eine Anhäufung von Replikationsgabeln an diesem Ort hinweist. Dies kann bei der Replikation sowohl haarnadelbildender Wiederholungssequenzen in Hefe 19,20,21 als auch von Triplex-bildenden Wiederholungen in menschlichen Zellen 22,23,24 beobachtet werden. Zusätzlich zum Stalling kann 2DGE verwendet werden, um DNA-Strukturen zu beobachten, die nicht mit den standardmäßigen einfachen Ys übereinstimmen, die während der Replikation gebildet werden, wie im Fall von rekombinanten Zwischenprodukten25. Diese Zwischenstufen haben eine schwerere und stärker verzweigte X-förmige Struktur und bewegen sich daher sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension langsamer als Standard-Replikationsgabeln. Ähnliche Ergebnisse sind auch in Bezug auf die Replikationsgabelumkehr 20,24,26 zu beobachten. Als Reaktion auf starken Replikationsstress wurde gezeigt, dass eukaryotische Zellen die Umkehrung der Replikationsgabel nutzen, um blockierte Gabeln zu retten. Diese umgekehrten Gabeln haben ein ähnliches Molekulargewicht wie blockierte Gabeln; ihre Hühnerfußstruktur führt jedoch zu einer langsameren elektrophoretischen Beweglichkeit in der zweiten Dimension im Vergleich zu ihren Y-förmigen Komplementen, was zu einer Ausdehnung des Lichtbogens nach oben und außen führt.
Abbildung 1: 2D-Gelelektrophorese-Analyse der DNA-Replikation. (A) Schematische Darstellung einer typischen 2DGE-Replikation, die die Replikation durch eine strukturbildende Wiederholung darstellt, die in der Lage ist, einen Gabelabriss zu induzieren. Die Zwischengröße und -struktur beeinflussen die elektrophoretische Mobilität. (B) Beispiel Y-Bogen mit aufsteigenden bzw. absteigenden Armen, beschriftet. Abkürzung: 2DGE = Zweidimensionale Neutral-/Neutral-Gel-Elektrophorese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Einer der wichtigsten Aspekte von 2DGE betrifft natürlich die Qualität und Quantität der Replikationszwischenprodukte. Die Auflösung der 2DGE-Analyse der Replikation durch endogene Loci in Säugetierzellen ist jedoch für eine Einzelkopien-Zielsequenz innerhalb des 6 × 109 bp diploiden menschlichen Genoms unzureichend, obwohl dies für Multi-Copy-Gene wie stark amplifizierten DHFR-Locus27 oder ribosomale RNA28 durchgeführt wurde. Die SV40-basierte Replikation ist ein effizientes und gut charakterisiertes Mittel zur Untersuchung der Replikation in eukaryotischen Zellen29. Es bietet ein zuverlässiges Modell der eukaryotischen Replikation, das den größten Teil der Wirtsreplysomenmaschinerie nutzt, um das virale Genom zu replizieren, das bei der Infektion in Nukleosomen unterteilt wird30,31. Zwei bemerkenswerte Ausnahmen vom Replisom von Säugetieren sind, dass das T-Antigen (Tag) anstelle des CMG-Komplexes des Wirts als replikative DNA-Helikase dient und die DNA-Polymerase delta sowohl führende als auch nachlaufende DNA-Stränge synthetisiert32. Wir haben uns dieses System zunutze gemacht, indem wir pathogene Abschnitte strukturbildender Wiederholungen stromabwärts von einem SV40-Replikationsursprung in ein Plasmid platziert haben, das ursprünglich im Labor22 von Massimo Lopes entwickelt wurde. Wichtig ist, dass dieses Plasmid auch das Gen enthält, das für Tag selbst kodiert, was zu seiner konstitutiven und äußerst potenten Replikation bei der Transfektion in eine Vielzahl von kultivierten menschlichen Zellen führt. Diese Eigenschaft führt zu einer großen Menge von Produkten, die sich ideal für die 2DGE-Analyse der Zwischenprodukte eignen, die während und als Reaktion auf die Replikation pathogener Wiederholungen in menschlichen Zellen gebildet werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Visualisierung der Replikation strukturbildender Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese.
2DGE liefert ein semiquantitatives und umfassendes Bild der relativen Populationen von Zwischenstufen, die während der Replikation einer bestimmten Sequenz entstehen. Da die fragilen molekularen Strukturen der Replikationsgabeln während dieses Verfahrens erhalten bleiben müssen, sollte große Sorgfalt walten gelassen werden, um physikalisches Scheren und chemische Denaturierung zu verhindern. Daher wird dringend empfohlen, während der Plasmidisolierung auf eine alkalische Behandlung …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Jorge Cebrian und Anastasia Rastokina, die mit der Entwicklung dieses Ansatzes in unserem Labor begonnen haben, Massimo Lopes für die Bereitstellung von pML113-Plasmid und unschätzbaren Ratschlägen, Ylli Doksani für aufschlussreiche Diskussionen und Mitgliedern des Mirkin-Labors für ihre Unterstützung. Die Arbeit im Mirkin-Labor wird vom National Institute of General Medical Sciences [R35GM130322] und NSF-BSF [2153071] unterstützt.
10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Additional restriction enzymes will need to be purchased as well |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |