Summary

Analyse électrophorétique de la réplication à travers des répétitions d’ADN à structure variable dans l’épisome humain basé sur SV40

Published: September 13, 2024
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Summary

Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Abstract

L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel neutre/neutre (2DGE) est apparue comme une technique de référence pour analyser la réplication de l’ADN à travers des obstacles naturels. Ce protocole décrit comment analyser la progression de la fourche de réplication à travers des répétitions d’ADN expansibles et susceptibles de structuration dans l’épisome basé sur le virus simien 40 (SV40) dans les cellules humaines. En bref, lors de la transfection du plasmide dans des cellules humaines, les intermédiaires de réplication sont isolés par le protocole Hirt modifié et traités avec l’enzyme de restriction DpnI pour éliminer l’ADN non répliqué. Les intermédiaires sont ensuite digérés par des enzymes de restriction appropriées pour placer la répétition d’intérêt dans la moitié distale d’origine d’un fragment d’ADN de 3 à 5 kb de long. Les intermédiaires de réplication sont séparés en deux dimensions perpendiculaires, d’abord par la taille, puis par la forme. Après l’hybridation par transfert de Southern, cette approche permet aux chercheurs d’observer le décrochage de la fourche à diverses répétitions structurelles sur la moitié descendante de l’arc Y de réplication. De plus, ce positionnement du site de décrochage permet de visualiser divers résultats du décrochage à médiation répétée, tels que l’inversion de la fourche, l’avènement d’une fourche convergente et le redémarrage de la fourche recombinatoire.

Introduction

Les courtes répétitions en tandem (STR) sont de petites paires de 2 à 9 paires de bases (pb), des séquences répétitives d’ADN qui constituent environ 3 % du génome humain1. Les STR jouent un rôle important dans la régulation des gènes2 ; cependant, leur composition répétitive les rend sujets à la formation d’une structure secondaire de l’ADN non canonique et à l’instabilité génétique ultérieure 3,4. Des hélices gauches aux épingles à cheveux/cruciformes, en passant par les hélices à trois et quatre brins, ces structures d’ADN alternatives posent des défis intrinsèques au réplisome. Une condition préalable naturelle à la formation d’une structure secondaire est le déroulement de l’ADN, qui est une condition préalable à la réplication de l’ADN. Cela présente une énigme unique pour le fonctionnement du génome, car bon nombre de ces structures peuvent se former pendant la réplication, entravant la progression du réplisome et provoquant finalement un blocage de la fourchede réplication 5,6,7 ou, dans les cas graves, un effondrement de la fourche et une rupture de l’ADN 8,9. Il a été démontré que le redémarrage des fourches bloquées et les voies de réparation de l’ADN entraînent des instabilités répétées, telles que des expansions répétées10,11 et des réarrangements génomiques complexes (CGR)12,13. Ces événements peuvent entraîner le développement d’environ 60 maladies humaines connues sous le nom de troubles d’expansion répétée, y compris le syndrome de l’X fragile, la maladie de Huntington, l’ataxie de Friedreich et d’autres14,15 ainsi que des maladies CGR, telles que le syndrome d’Emmanuel16. Par conséquent, pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie humaine entraînée par l’instabilité des répétitions, il est impératif d’étudier les détails de la progression de la fourche de réplication à travers ces répétitions.

Une technique d’étude de la progression de la réplication est apparue au milieu des années 1980 lorsque Brewer et Fangman ont cherché à fournir des preuves directes que l’initiation de la réplication chez Saccharomyces cerevisiae se produit au niveau des éléments17 de la séquence de réplication autonome (communément appelée ARS). Ce faisant, ils ont séparé les structures des intermédiaires de réplication de la levure dans l’agarose, adaptant une méthode antérieure de Bell et Byers connue sous le nom d’électrophorèse sur gel neutre/neutre en 2 dimensions (2DGE)18. Cette technique a utilisé le fait que l’ADN non linéaire se déplace différemment dans le gel d’agarose que son équivalent linéaire de la même masse. Plus précisément, dans la 2DGE, l’ADN isolé est séparé en deux dimensions perpendiculaires, d’abord principalement par taille, puis principalement par forme, pour créer une carte complète de la réplication dans une région d’intérêt particulière. Dans leur article original, Brewer et Fangman ont démontré qu’il s’agissait d’un arc composé de structures en « Y simples » ou de fourches de réplication reliant l’ADN non répliqué à leurs homologues répliqués. Ils décrivent en outre d’autres intermédiaires observés comme des « bulles » et des « doubles Y », représentant respectivement les origines de réplication et les fourches convergentes.

La 2DGE peut être utilisée pour étudier les populations relatives d’intermédiaires de réplication de l’ADN à un moment donné. Par conséquent, si une population d’intermédiaires est plus répandue qu’une autre, cela serait évident à la visualisation. Cela fait de 2DGE un outil particulièrement utile pour étudier la progression de la réplication à travers des séquences difficiles, comme les répétitions formant la structure. Par exemple, si la région analysée contient une séquence capable d’induire un blocage de la fourche de réplication, cela se présenterait comme un renflement sur l’arc (Figure 1A), indiquant une accumulation de fourches de réplication à ce locus. Cela peut être observé avec la réplication des séquences de répétition formant des épingles à cheveux dans la levure 19,20,21 et des répétitions formant des triplex dans les cellules humaines 22,23,24. En plus du calage, la 2DGE peut être utilisée pour observer les structures de l’ADN qui ne sont pas conformes aux Y simples standard formés lors de la réplication, comme dans le cas des intermédiaires recombinants25. Ces intermédiaires ont une structure en forme de X plus lourde et plus ramifiée et, par conséquent, se déplacent plus lentement dans la première et la deuxième dimension que les fourches de réplication standard. Des résultats similaires peuvent également être observés en ce qui concerne l’inversion de la fourche de réplication 20,24,26. En réponse à un fort stress de réplication, il a été démontré que les cellules eucaryotes utilisent l’inversion de la fourche de réplication pour sauver les fourches bloquées. Ces fourches inversées ont un poids moléculaire similaire à celui des fourches bloquées ; cependant, leur structure en patte de poulet entraîne une mobilité électrophorétique plus lente dans la deuxième dimension par rapport à leurs compléments en forme de Y, ce qui entraîne une extension vers le haut et vers l’extérieur de l’arc.

Figure 1
Figure 1 : Analyse par électrophorèse sur gel 2D de la réplication de l’ADN. (A) Schéma d’une 2DGE typique décrivant la réplication par une répétition formant une structure capable d’induire un décrochage de la fourche. La taille et la structure intermédiaires influenceront la mobilité électrophorétique. (B) Échantillon d’arc en Y avec les bras ascendant et descendant respectivement étiquetés. Abréviation : 2DGE = Électrophorèse sur gel neutre/neutre bidimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Naturellement, l’un des aspects les plus importants de la 2DGE concerne la qualité et la quantité des intermédiaires de réplication. Cependant, la résolution de l’analyse 2DGE de la réplication à travers des loci endogènes dans des cellules de mammifères est insuffisante pour une séquence cible à copie unique dans le génome humain diploïde de 6 × 10à 9 pb, bien qu’elle ait été réalisée pour des gènes à copies multiples, tels que le locus27 DHFR fortement amplifié ou l’ARN ribosomique28. La réplication basée sur SV40 est un moyen efficace et bien caractérisé d’étudier la réplication dans les cellules eucaryotes29. Il fournit un modèle fiable de réplication eucaryote qui utilise la majeure partie de la machinerie du réplisome de l’hôte pour répliquer le génome viral, qui est divisé en nucléosomes lors de l’infection30,31. Deux exceptions notables au réplisome des mammifères sont que l’antigène T (Tag), au lieu du complexe CMG de l’hôte, sert d’ADN hélicase réplicatif, et que l’ADN polymérase delta synthétise à la fois les brins d’ADN principaux et retardés32. Nous avons tiré parti de ce système en plaçant des tronçons pathogènes de répétitions structurantes en aval d’une origine de réplication SV40 dans un plasmide créé à l’origine dans le laboratoire de Massimo Lopes22. Il est important de noter que ce plasmide contient également le gène codant pour Tag lui-même, ce qui entraîne sa réplication constitutive et extrêmement puissante lors de la transfection dans une variété de cellules humaines cultivées. Cette caractéristique donne lieu à une grande quantité de produits, idéale pour l’analyse 2DGE des intermédiaires formés pendant et en réponse à la réplication de répétitions pathogènes dans les cellules humaines. Ici, nous décrivons une méthode détaillée de visualisation de la réplication des répétitions formant la structure dans l’épisome humain basé sur SV40 à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Protocol

REMARQUE : Le plasmide conçu pour notre analyse 2DGE décrite dans les cellules de mammifères doit contenir une origine SV40 de réplication plusieurs kb en amont des répétitions sujettes à la structure (Figure 2). Les synthèses en amont et en aval doivent être gardées à l’esprit lors du choix de l’orientation par rapport à l’origine des répétitions à cloner dans le plasmide. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-pa…

Representative Results

En cas de succès, lors de la visualisation, on peut observer un arc aigu de fourches de réplication s’étendant vers le haut et vers l’extérieur à partir de l’énorme point 1n (Figure 5A). La taille d’un fragment, ou le pourcentage de réplication, détermine la mobilité du fragment dans la première dimension. Au fur et à mesure que les intermédiaires développent une structure plus articulée, ils commenceront à se déplacer plus lentement …

Discussion

2DGE fournit une image semi-quantitative et complète des populations relatives d’intermédiaires qui apparaissent lors de la réplication d’une séquence particulière. Étant donné que les structures moléculaires fragiles des fourches de réplication doivent être maintenues tout au long de cette procédure, une grande prudence doit être mise en œuvre pour éviter le cisaillement physique et la dénaturation chimique. Par conséquent, il est fortement recommandé d’éviter to…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Jorge Cebrian et Anastasia Rastokina qui ont commencé à développer cette approche dans notre laboratoire, Massimo Lopes pour nous avoir fourni le plasmide pML113 et des conseils inestimables, Ylli Doksani pour les discussions perspicaces, et les membres du laboratoire Mirkin pour leur soutien. Les travaux du laboratoire Mirkin sont soutenus par le National Institute of General Medical Sciences [R35GM130322] et la NSF-BSF [2153071].

Materials

10x TBE Buffer Bio Rad 1610733
20x SSC Buffer Fisher Scientific BP1325-1
293T cells ATCC CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol  Revvity BLU512H250UC
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Amersham Hybond-N+ Fisher Scientific RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens Fisher Scientific 28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer Fisher Scientific 50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit ThermoFisher Scientific K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate ThermoFisher Scientific 10569010
DpnI New England Biolabs R0176S Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8 Fisher Scientific BP2482500
Ethanol, 70% Fisher Scientific BP82031GAL
Fetal Bovine Serum  VWR 97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M Millipore Sigma 13-1683
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer VWR 101000027
MycoZap Plus-CL VWR 75870-448
NaCl Millipore Sigma 746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 ThermoFisher Scientific 10010024
Proteinase K ThermoFisher Scientific EO0491
Proteinase K ThermoFisher Scientific EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Ruler Fisher Scientific 09-016
Scalpel Fisher Scientific 12-460-451
Sodium dodecyl sulfate Millipore Sigma 436143-25G
Sodium hydroxide Fisher Scientific S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System Bio Rad 1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor ThermoFisher Scientific 75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 Fisher Scientific BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 25200056

References

  1. Liao, X., et al. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).
  2. Fotsing, S. F., et al. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).
  3. Fan, H., Chu, J. -. Y. A brief review of short tandem repeat mutation. GPB. 5 (1), 7-14 (2007).
  4. Khristich, A. N., Mirkin, S. M. On the wrong DNA track: Molecular mechanisms of repeat-mediated genome instability. J Biol Chem. 295 (13), 4134-4170 (2020).
  5. Samadashwily, G. M., Raca, G., Mirkin, S. M. Trinucleotide repeats affect DNA replication in vivo. Nat Genet. 17 (3), 298-304 (1997).
  6. Khristich, A. N., Armenia, J. F., Matera, R. M., Kolchinski, A. A., Mirkin, S. M. Large-scale contractions of Friedreich’s ataxia GAA repeats in yeast occur during DNA replication due to their triplex-forming ability. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (3), 1628-1637 (2020).
  7. Shishkin, A. A., et al. Large-scale expansions of Friedreich’s ataxia GAA repeats in yeast. Mol Cell. 35 (1), 82-92 (2009).
  8. Sundararajan, R., Gellon, L., Zunder, R. M., Freudenreich, C. H. Double-strand break repair pathways protect against CAG/CTG repeat expansions, contractions and repeat-mediated chromosomal fragility in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 184 (1), 65-77 (2010).
  9. Kim, H. -. M., et al. Chromosome fragility at GAA tracts in yeast depends on repeat orientation and requires mismatch repair. EMBO J. 27 (21), 2896-2906 (2008).
  10. Polleys, E. J., House, N. C. M., Freudenreich, C. H. Role of recombination and replication fork restart in repeat instability. DNA Repair. 56, 156-165 (2017).
  11. Gold, M. A., et al. Restarted replication forks are error-prone and cause CAG repeat expansions and contractions. PLoS Genet. 17 (10), e1009863 (2021).
  12. Lambert, S., et al. Homologous recombination restarts blocked replication forks at the expense of genome rearrangements by template exchange. Mol Cell. 39 (3), 346-359 (2010).
  13. Burssed, B., Zamariolli, M., Bellucco, F. T., Melaragno, M. I. Mechanisms of structural chromosomal rearrangement formation. Mol Cytogenet. 15 (1), 23 (2022).
  14. Paulson, H. Repeat expansion diseases. Handb Clin Neurol. 147, 105-123 (2018).
  15. Malik, I., Kelley, C. P., Wang, E., Todd, P. Molecular mechanisms underlying nucleotide repeat expansion disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (9), 589-607 (2021).
  16. Emanuel, B. S., Zackai, E. H., Medne, L., Adam, M. P. Emanuel Syndrome. GeneReviews®. , (1993).
  17. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
  18. Bell, L., Byers, B. Separation of branched from linear DNA by two-dimensional gel electrophoresis. Anal Biochem. 130 (2), 527-535 (1983).
  19. Voineagu, I., Narayanan, V., Lobachev, K. S., Mirkin, S. M. Replication stalling at unstable inverted repeats: Interplay between DNA hairpins and fork stabilizing proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (29), 9936-9941 (2008).
  20. Nguyen, J. H. G., et al. Differential requirement of Srs2 helicase and Rad51 displacement activities in replication of hairpin-forming CAG/CTG repeats. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4519-4531 (2017).
  21. Krasilnikova, M. M., Mirkin, S. M., Kohwi, Y. Analysis of triplet repeat replication by two-dimensional gel electrophoresis. Trinucleotide Repeat Protocols. , (2004).
  22. Follonier, C., Oehler, J., Herrador, R., Lopes, M. Friedreich’s ataxia-associated GAA repeats induce replication-fork reversal and unusual molecular junctions. Nat Struct Mol Biol. 20 (4), 486-494 (2013).
  23. Chandok, G. S., Patel, M. P., Mirkin, S. M., Krasilnikova, M. M. Effects of Friedreich’s ataxia GAA repeats on DNA replication in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 40 (9), 3964-3974 (2012).
  24. Rastokina, A., et al. Large-scale expansions of Friedreich’s ataxia GAA•TTC repeats in an experimental human system: role of DNA replication and prevention by LNA-DNA oligonucleotides and PNA oligomers. Nucleic Acids Res. 51 (16), 8532-8549 (2023).
  25. Giannattasio, M., et al. Visualization of recombination-mediated damage-bypass by template switching. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 884-892 (2014).
  26. Hisey, J. A., et al. Pathogenic CANVAS (AAGGG)n repeats stall DNA replication due to the formation of alternative DNA structures. Nucleic Acids Res. 52 (8), 4361-4374 (2024).
  27. Kalejta, R. F., Lin, H. B., Dijkwel, P. A., Hamlin, J. L. Characterizing replication intermediates in the amplified CHO dihydrofolate reductase domain by two novel gel electrophoretic techniques. Mol Cell Biol. 16 (9), 4923-4931 (1996).
  28. Little, R. D., Platt, T. H., Schildkraut, C. L. Initiation and termination of DNA replication in human rRNA genes. Mol Cell Biol. 13 (10), 6600-6613 (1993).
  29. Fanning, E., Zhao, K. SV40 DNA replication: From the A gene to a nanomachine. Virology. 384 (2), 352-359 (2009).
  30. Sogo, J. M., Stahl, H., Koller, T., Knippers, R. Structure of replicating simian virus 40 minichromosomes: The replication fork, core histone segregation and terminal structures. J Mol Biol. 189 (1), 189-204 (1986).
  31. Weisshart, K., Taneja, P., Fanning, E. The replication protein A binding site in simian virus 40 (SV40) T antigen and its role in the initial steps of SV40 DNA replication. J Virol. 72 (12), 9771-9781 (1998).
  32. Sowd, G. A., Fanning, E. A Wolf in sheep’s clothing: SV40 co-opts host genome maintenance proteins to replicate viral DNA. PLoS Pathog. 8 (11), e1002994 (2012).
  33. . BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2024)
  34. Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
  35. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Mol Cell. 21 (1), 15-27 (2006).

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Citer Cet Article
Mandel, N. H., Mirkin, S. M. Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome. J. Vis. Exp. (211), e67229, doi:10.3791/67229 (2024).

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