Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.
L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel neutre/neutre (2DGE) est apparue comme une technique de référence pour analyser la réplication de l’ADN à travers des obstacles naturels. Ce protocole décrit comment analyser la progression de la fourche de réplication à travers des répétitions d’ADN expansibles et susceptibles de structuration dans l’épisome basé sur le virus simien 40 (SV40) dans les cellules humaines. En bref, lors de la transfection du plasmide dans des cellules humaines, les intermédiaires de réplication sont isolés par le protocole Hirt modifié et traités avec l’enzyme de restriction DpnI pour éliminer l’ADN non répliqué. Les intermédiaires sont ensuite digérés par des enzymes de restriction appropriées pour placer la répétition d’intérêt dans la moitié distale d’origine d’un fragment d’ADN de 3 à 5 kb de long. Les intermédiaires de réplication sont séparés en deux dimensions perpendiculaires, d’abord par la taille, puis par la forme. Après l’hybridation par transfert de Southern, cette approche permet aux chercheurs d’observer le décrochage de la fourche à diverses répétitions structurelles sur la moitié descendante de l’arc Y de réplication. De plus, ce positionnement du site de décrochage permet de visualiser divers résultats du décrochage à médiation répétée, tels que l’inversion de la fourche, l’avènement d’une fourche convergente et le redémarrage de la fourche recombinatoire.
Les courtes répétitions en tandem (STR) sont de petites paires de 2 à 9 paires de bases (pb), des séquences répétitives d’ADN qui constituent environ 3 % du génome humain1. Les STR jouent un rôle important dans la régulation des gènes2 ; cependant, leur composition répétitive les rend sujets à la formation d’une structure secondaire de l’ADN non canonique et à l’instabilité génétique ultérieure 3,4. Des hélices gauches aux épingles à cheveux/cruciformes, en passant par les hélices à trois et quatre brins, ces structures d’ADN alternatives posent des défis intrinsèques au réplisome. Une condition préalable naturelle à la formation d’une structure secondaire est le déroulement de l’ADN, qui est une condition préalable à la réplication de l’ADN. Cela présente une énigme unique pour le fonctionnement du génome, car bon nombre de ces structures peuvent se former pendant la réplication, entravant la progression du réplisome et provoquant finalement un blocage de la fourchede réplication 5,6,7 ou, dans les cas graves, un effondrement de la fourche et une rupture de l’ADN 8,9. Il a été démontré que le redémarrage des fourches bloquées et les voies de réparation de l’ADN entraînent des instabilités répétées, telles que des expansions répétées10,11 et des réarrangements génomiques complexes (CGR)12,13. Ces événements peuvent entraîner le développement d’environ 60 maladies humaines connues sous le nom de troubles d’expansion répétée, y compris le syndrome de l’X fragile, la maladie de Huntington, l’ataxie de Friedreich et d’autres14,15 ainsi que des maladies CGR, telles que le syndrome d’Emmanuel16. Par conséquent, pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie humaine entraînée par l’instabilité des répétitions, il est impératif d’étudier les détails de la progression de la fourche de réplication à travers ces répétitions.
Une technique d’étude de la progression de la réplication est apparue au milieu des années 1980 lorsque Brewer et Fangman ont cherché à fournir des preuves directes que l’initiation de la réplication chez Saccharomyces cerevisiae se produit au niveau des éléments17 de la séquence de réplication autonome (communément appelée ARS). Ce faisant, ils ont séparé les structures des intermédiaires de réplication de la levure dans l’agarose, adaptant une méthode antérieure de Bell et Byers connue sous le nom d’électrophorèse sur gel neutre/neutre en 2 dimensions (2DGE)18. Cette technique a utilisé le fait que l’ADN non linéaire se déplace différemment dans le gel d’agarose que son équivalent linéaire de la même masse. Plus précisément, dans la 2DGE, l’ADN isolé est séparé en deux dimensions perpendiculaires, d’abord principalement par taille, puis principalement par forme, pour créer une carte complète de la réplication dans une région d’intérêt particulière. Dans leur article original, Brewer et Fangman ont démontré qu’il s’agissait d’un arc composé de structures en « Y simples » ou de fourches de réplication reliant l’ADN non répliqué à leurs homologues répliqués. Ils décrivent en outre d’autres intermédiaires observés comme des « bulles » et des « doubles Y », représentant respectivement les origines de réplication et les fourches convergentes.
La 2DGE peut être utilisée pour étudier les populations relatives d’intermédiaires de réplication de l’ADN à un moment donné. Par conséquent, si une population d’intermédiaires est plus répandue qu’une autre, cela serait évident à la visualisation. Cela fait de 2DGE un outil particulièrement utile pour étudier la progression de la réplication à travers des séquences difficiles, comme les répétitions formant la structure. Par exemple, si la région analysée contient une séquence capable d’induire un blocage de la fourche de réplication, cela se présenterait comme un renflement sur l’arc (Figure 1A), indiquant une accumulation de fourches de réplication à ce locus. Cela peut être observé avec la réplication des séquences de répétition formant des épingles à cheveux dans la levure 19,20,21 et des répétitions formant des triplex dans les cellules humaines 22,23,24. En plus du calage, la 2DGE peut être utilisée pour observer les structures de l’ADN qui ne sont pas conformes aux Y simples standard formés lors de la réplication, comme dans le cas des intermédiaires recombinants25. Ces intermédiaires ont une structure en forme de X plus lourde et plus ramifiée et, par conséquent, se déplacent plus lentement dans la première et la deuxième dimension que les fourches de réplication standard. Des résultats similaires peuvent également être observés en ce qui concerne l’inversion de la fourche de réplication 20,24,26. En réponse à un fort stress de réplication, il a été démontré que les cellules eucaryotes utilisent l’inversion de la fourche de réplication pour sauver les fourches bloquées. Ces fourches inversées ont un poids moléculaire similaire à celui des fourches bloquées ; cependant, leur structure en patte de poulet entraîne une mobilité électrophorétique plus lente dans la deuxième dimension par rapport à leurs compléments en forme de Y, ce qui entraîne une extension vers le haut et vers l’extérieur de l’arc.
Figure 1 : Analyse par électrophorèse sur gel 2D de la réplication de l’ADN. (A) Schéma d’une 2DGE typique décrivant la réplication par une répétition formant une structure capable d’induire un décrochage de la fourche. La taille et la structure intermédiaires influenceront la mobilité électrophorétique. (B) Échantillon d’arc en Y avec les bras ascendant et descendant respectivement étiquetés. Abréviation : 2DGE = Électrophorèse sur gel neutre/neutre bidimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Naturellement, l’un des aspects les plus importants de la 2DGE concerne la qualité et la quantité des intermédiaires de réplication. Cependant, la résolution de l’analyse 2DGE de la réplication à travers des loci endogènes dans des cellules de mammifères est insuffisante pour une séquence cible à copie unique dans le génome humain diploïde de 6 × 10à 9 pb, bien qu’elle ait été réalisée pour des gènes à copies multiples, tels que le locus27 DHFR fortement amplifié ou l’ARN ribosomique28. La réplication basée sur SV40 est un moyen efficace et bien caractérisé d’étudier la réplication dans les cellules eucaryotes29. Il fournit un modèle fiable de réplication eucaryote qui utilise la majeure partie de la machinerie du réplisome de l’hôte pour répliquer le génome viral, qui est divisé en nucléosomes lors de l’infection30,31. Deux exceptions notables au réplisome des mammifères sont que l’antigène T (Tag), au lieu du complexe CMG de l’hôte, sert d’ADN hélicase réplicatif, et que l’ADN polymérase delta synthétise à la fois les brins d’ADN principaux et retardés32. Nous avons tiré parti de ce système en plaçant des tronçons pathogènes de répétitions structurantes en aval d’une origine de réplication SV40 dans un plasmide créé à l’origine dans le laboratoire de Massimo Lopes22. Il est important de noter que ce plasmide contient également le gène codant pour Tag lui-même, ce qui entraîne sa réplication constitutive et extrêmement puissante lors de la transfection dans une variété de cellules humaines cultivées. Cette caractéristique donne lieu à une grande quantité de produits, idéale pour l’analyse 2DGE des intermédiaires formés pendant et en réponse à la réplication de répétitions pathogènes dans les cellules humaines. Ici, nous décrivons une méthode détaillée de visualisation de la réplication des répétitions formant la structure dans l’épisome humain basé sur SV40 à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.
2DGE fournit une image semi-quantitative et complète des populations relatives d’intermédiaires qui apparaissent lors de la réplication d’une séquence particulière. Étant donné que les structures moléculaires fragiles des fourches de réplication doivent être maintenues tout au long de cette procédure, une grande prudence doit être mise en œuvre pour éviter le cisaillement physique et la dénaturation chimique. Par conséquent, il est fortement recommandé d’éviter to…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Jorge Cebrian et Anastasia Rastokina qui ont commencé à développer cette approche dans notre laboratoire, Massimo Lopes pour nous avoir fourni le plasmide pML113 et des conseils inestimables, Ylli Doksani pour les discussions perspicaces, et les membres du laboratoire Mirkin pour leur soutien. Les travaux du laboratoire Mirkin sont soutenus par le National Institute of General Medical Sciences [R35GM130322] et la NSF-BSF [2153071].
10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Additional restriction enzymes will need to be purchased as well |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |