在这里,我们概述了使用 2 维凝胶电泳通过致病性、易结构重复分析复制进程的程序。
二维中性/中性凝胶电泳 (2DGE) 成为分析通过自然障碍进行 DNA 复制的基准技术。该方案描述了如何通过人类细胞中基于猿猴病毒 40 (SV40) 的附加体内易结构、可扩增的 DNA 重复序列分析复制叉进程。简而言之,在质粒转染到人细胞中后,通过改良的 Hirt 方案分离复制中间体,并用 DpnI 限制性内切酶处理以去除未复制的 DNA。然后用适当的限制性内切酶消化中间体,将目标重复序列置于 3-5 kb 长的 DNA 片段的起点远端半部分内。复制中间体分为两个垂直维度,首先按大小,然后按形状。在 Southern 印迹杂交之后,这种方法允许研究人员在复制 Y 弧的下半部分观察到各种结构形成重复的叉停滞。此外,stall 站点的这种定位允许可视化重复介导的 fork stalling 的各种结果,例如分叉反转、收敛分叉的出现和重组分叉重启。
短串联重复序列 (STR) 是小的、通常为 2-9 个碱基对 (bp) 的重复 DNA 序列,约占人类基因组的 3%1。STR 在基因调控中起重要作用2;然而,它们的重复组成使它们容易形成非经典 DNA 二级结构并随后出现遗传不稳定性 3,4。从左旋螺旋到发夹/十字形,再到三链和四链螺旋,这些替代 DNA 结构对复制体造成了内在挑战。二级结构形成的自然先决条件是 DNA 解旋,这是 DNA 复制的先决条件。这给基因组功能带来了一个独特的难题,因为许多这些结构会在复制过程中形成,阻碍复制体的进展,并最终导致复制叉停滞 5,6,7,或者在严重的情况下,导致叉崩溃和 DNA 断裂 8,9。停滞分叉的重新启动和 DNA 修复途径已被证明都会导致重复不稳定性,例如重复扩增10,11 和复杂基因组重排 (CGR) 12,13。这些事件可导致大约 60 种被称为重复扩增障碍的人类疾病的发展,包括脆性 X 综合征、亨廷顿病、弗里德赖希共济失调等14,15 以及 CGR 疾病,如伊曼纽尔综合征16。因此,为了更好地了解重复不稳定性驱动的人类疾病机制,必须研究通过这些重复的复制叉进展的细节。
一种研究复制过程的技术出现在 1980 年代中期,当时 Brewer 和 Fangman 试图提供直接证据,证明 酿酒 酵母的复制起始发生在自主复制序列(通常称为 ARS)元件17。在此过程中,他们分离了琼脂糖中酵母复制中间体的结构,采用了 Bell 和 Byers 的早期方法,称为二维中性/中性凝胶电泳 (2DGE)18。该技术利用了非线性 DNA 在琼脂糖凝胶中的移动方式与相同质量的线性当量不同的事实。更具体地说,在 2DGE 中,分离的 DNA 在两个垂直维度上分离,首先主要按大小分离,然后主要按形状分离,以在特定目标区域创建全面的复制图谱。在他们的原始论文中,Brewer 和 Fangman 将其证明为由“简单 Y”结构或复制叉组成的弧线,将未复制的 DNA 与复制的 DNA 连接起来。他们进一步将其他观察到的中间体描述为 “气泡” 和 “双 Y”,分别代表复制起点和收敛分叉。
2DGE 可用于研究给定时间 DNA 复制中间体的相对群体。因此,如果一个中间体群体比另一个群体更普遍,这在可视化时就会很明显。这使得 2DGE 成为通过具有挑战性的序列(如结构形成重复序列)研究复制进程的特别有用的工具。例如,如果分析的区域包含能够诱导复制叉停滞的序列,这将表现为弧上的凸起(图 1A),表明复制叉在该基因座的积累。这可以从酵母中发夹形成重复序列 19,20,21 和人类细胞中三链形成重复序列的复制中看出 22,23,24。除了停滞之外,2DGE 还可用于观察不符合复制过程中形成的标准简单 Y 的 DNA 结构,如重组中间体25。这些中间体具有更重、更支化的 X 形结构,因此在第一维和第二维的移动速度都比标准复制叉慢。在复制叉反转 20,24,26 中也可以观察到类似的结果。为了应对强大的复制应激,真核细胞已被证明可以利用复制叉反转来挽救停滞的叉。这些反向叉子具有与停滞叉子相似的分子量;然而,相对于它们的 Y 形互补体,它们的鸡脚结构导致第二维的电泳迁移率较慢,从而导致电弧向上和向外延伸。
图 1:DNA 复制的 2D 凝胶电泳分析。 (A) 典型 2DGE 的示意图,它通过能够诱导叉停滞的结构形成重复序列进行复制。中等尺寸和结构会影响电泳迁移率。(B) 分别标记了上升臂和下降臂的 Y 轴样本。缩写:2DGE = 二维中性/中性凝胶电泳。 请单击此处查看此图的较大版本。
当然,2DGE 最重要的方面之一涉及复制中间体的质量和数量。然而,对于哺乳动物细胞中内源性基因座复制的 2DGE 分析对于人类基因组中 6 ×10 bp 9 bp 二倍体人类基因组内的单拷贝靶序列是不够的,尽管已经对多拷贝基因进行了解析,例如大量扩增的 DHFR 基因座27 或核糖体 RNA28。基于 SV40 的复制是研究真核细胞复制的一种有效且特征明确的方法29。它提供了一种可靠的真核复制模型,利用大多数宿主复制体机制来复制病毒基因组,病毒基因组在感染后被打包到核小体中 30,31。哺乳动物复制体的两个显著例外是 T 抗原 (Tag) 而不是宿主 CMG 复合物,用作复制 DNA 解旋酶,并且 DNA 聚合酶 delta 合成前导和滞后 DNA 链32。我们利用该系统,将 SV40 复制起点下游的致病性结构形成重复序列放置在最初在 Massimo Lopes 实验室22 中创建的质粒中。重要的是,该质粒还包含编码 Tag 本身的基因,因此在转染到各种培养的人类细胞中时,其产生组成型和极其有效的复制。这一特性产生了大量的产物,非常适合对人类细胞中致病性重复序列复制过程中和响应过程中形成的中间体进行 2DGE 分析。在这里,我们描述了一种使用 2 维凝胶电泳可视化基于 SV40 的人游离体内结构形成重复序列复制的详细方法。
2DGE 提供了特定序列复制过程中出现的中间体相对群体的半定量和综合图像。鉴于在整个过程中必须保持复制叉的脆弱分子结构,因此应非常小心地防止物理剪切和化学变性。因此,强烈建议在质粒分离过程中避免任何碱性处理。为避免这种情况,我们和其他人实施了 Hirt 于 1967 年建立的 Hirt DNA 分离的改良形式33。在这里,通过在 4 °C 下用 1 M NaCl 处理?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Jorge Cebrian 和 Anastasia Rastokina 在我们的实验室开始开发这种方法,感谢 Massimo Lopes 为我们提供 pML113 质粒和宝贵的建议,感谢 Ylli Doksani 的深入讨论,以及 Mirkin 实验室成员的支持。Mirkin 实验室的工作得到了美国国家普通医学科学研究所 [R35GM130322] 和 NSF-BSF [2153071] 的支持。
10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Additional restriction enzymes will need to be purchased as well |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |