Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.
La electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro (2DGE) surgió como una técnica de referencia para analizar la replicación del ADN a través de impedimentos naturales. Este protocolo describe cómo analizar la progresión de la horquilla de replicación a través de repeticiones de ADN expandibles y propensas a la estructura dentro del episoma basado en el virus del simio 40 (SV40) en células humanas. En resumen, tras la transfección de plásmidos en células humanas, los intermedios de replicación se aíslan mediante el protocolo Hirt modificado y se tratan con la enzima de restricción DpnI para eliminar el ADN no replicado. A continuación, los intermedios son digeridos por enzimas de restricción apropiadas para colocar la repetición de interés dentro de la mitad distal de origen de un fragmento de ADN de 3-5 kb de largo. Los intermedios de replicación se separan en dos dimensiones perpendiculares, primero por tamaño y luego por forma. Después de la hibridación de Southern blot, este enfoque permite a los investigadores observar el estancamiento de la horquilla en varias repeticiones de formación de estructuras en la mitad descendente del arco Y de replicación. Además, este posicionamiento del sitio de pérdida permite la visualización de varios resultados del estancamiento de la horquilla mediado por repetición, como la inversión de la horquilla, el advenimiento de una horquilla convergente y el reinicio recombinante de la horquilla.
Las repeticiones cortas en tándem (STR) son secuencias repetitivas de ADN pequeñas, normalmente de 2 a 9 pares de bases (bp), que constituyen alrededor del 3%del genoma humano. Los STR juegan un papel importante en la regulación génica2; sin embargo, su composición repetitiva los hace propensos a la formación de estructuras secundarias de ADN no canónicas y a la posterior inestabilidad genética 3,4. Desde las hélices levógiras hasta las horquillas/cruciformes, pasando por las hélices de tres y cuatro hebras, estas estructuras alternativas de ADN causan desafíos intrínsecos para el replisoma. Un requisito natural para la formación de estructuras secundarias es el desenrollado del ADN, que es un requisito previo para la replicación del ADN. Esto presenta un enigma único para el funcionamiento del genoma, ya que muchas de estas estructuras pueden formarse durante la replicación, lo que dificulta la progresión del replicación y, en última instancia, causa el estancamiento de la horquilla de replicación 5,6,7 o, en casos graves, el colapso de la horquilla y la rotura del ADN 8,9. Se ha demostrado que tanto el reinicio de las horquillas estancadas como las vías de reparación del ADN conducen a inestabilidad repetida, como expansiones repetidas10,11 y reordenamientos complejos del genoma (CGR)12,13. Estos eventos pueden resultar en el desarrollo de aproximadamente 60 enfermedades humanas conocidas como trastornos de expansión repetida, incluyendo el síndrome de X frágil, la enfermedad de Huntington, la ataxia de Friedreich y otras14,15, así como enfermedades CGR, como el síndrome de Emmanuel16. Por lo tanto, para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades humanas impulsadas por la inestabilidad de las repeticiones, es imperativo estudiar los detalles de la progresión de la horquilla de replicación a través de esas repeticiones.
Una técnica para estudiar la progresión de la replicación surgió a mediados de la década de 1980 cuando Brewer y Fangman buscaron proporcionar evidencia directa de que el inicio de la replicación en Saccharomyces cerevisiae ocurre en elementos de secuencia de replicación autónoma (comúnmente conocida como ARS)17. Al hacerlo, separaron las estructuras de los intermedios de replicación de la levadura en la agarosa, adaptando un método anterior de Bell y Byers conocido como electroforesis en gel neutra/neutro en 2 dimensiones (2DGE)18. Esta técnica utilizó el hecho de que el ADN no lineal viaja de manera diferente en gel de agarosa que su equivalente lineal de la misma masa. Más específicamente, en 2DGE, el ADN aislado se separa en dos dimensiones perpendiculares, primero principalmente por tamaño y luego principalmente por forma, para crear un mapa completo de la replicación en una región particular de interés. En su artículo original, Brewer y Fangman demostraron esto como un arco compuesto por estructuras “Y simples” o horquillas de replicación que unen el ADN no replicado con sus contrapartes replicadas. Además, describen otros intermedios observados como “burbujas” y “dobles Y”, que representan orígenes de replicación y horquillas convergentes, respectivamente.
2DGE se puede utilizar para estudiar las poblaciones relativas de intermediarios de replicación del ADN en un momento dado. Por lo tanto, si una población de intermediarios es más prevalente que otra, esto sería evidente en la visualización. Esto hace que 2DGE sea una herramienta especialmente útil para estudiar la progresión de la replicación a través de secuencias desafiantes, como las repeticiones de formación de estructuras. Por ejemplo, si la región analizada contiene una secuencia capaz de inducir el estancamiento de la horquilla de replicación, esto se presentaría como una protuberancia en el arco (Figura 1A), lo que indica una acumulación de bifurcaciones de replicación en ese locus. Esto se puede ver con la replicación de las secuencias de repeticiones que forman horquillas en la levadura 19,20,21 y las repeticiones que forman triplex en células humanas 22,23,24. Además del estancamiento, el 2DGE se puede utilizar para observar estructuras de ADN que no se ajustan a los Ys simples estándar formados durante la replicación, como en el caso de los intermedios recombinantes25. Estos intermedios tienen una estructura en forma de X más pesada y ramificada y, por lo tanto, viajan más lentamente tanto en la primera como en la segunda dimensión que las horquillas de replicación estándar. También se pueden observar resultados similares con respecto a la inversión de la horquilla de replicación 20,24,26. En respuesta al fuerte estrés de replicación, se ha demostrado que las células eucariotas utilizan la inversión de la horquilla de replicación para rescatar las horquillas estancadas. Estas horquillas invertidas tienen un peso molecular similar al de las horquillas estancadas; sin embargo, su estructura de pata de gallina da como resultado una movilidad electroforética más lenta en la segunda dimensión en relación con sus complementos en forma de Y, lo que resulta en una extensión hacia arriba y hacia afuera del arco.
Figura 1: Análisis de electroforesis en gel 2D de la replicación del ADN. (A) Esquema de un 2DGE típico que representa la replicación a través de una repetición de formación de estructura capaz de inducir el estancamiento de la horquilla. El tamaño y la estructura intermedios influirán en la movilidad electroforética. (B) Arco Y de muestra con brazos ascendentes y descendentes respectivamente etiquetados. Abreviatura: 2DGE = Electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Naturalmente, uno de los aspectos más importantes de 2DGE se refiere a la calidad y cantidad de los intermedios de replicación. Sin embargo, la resolución del análisis 2DGE de la replicación a través de loci endógenos en células de mamíferos es insuficiente para una secuencia diana de una sola copia dentro del genoma humano diploide de 6 × 109 pb, aunque se ha hecho para genes de múltiples copias, como el locusDHFR 27 fuertemente amplificado o el ARN ribosómico28. La replicación basada en SV40 es un medio eficiente y bien caracterizado para estudiar la replicación en células eucariotas29. Proporciona un modelo fiable de replicación eucariota que utiliza la mayor parte de la maquinaria de reploma del huésped para replicar el genoma viral, que se parcela en nucleosomas tras la infección30,31. Dos excepciones notables del replisma de mamíferos son que el antígeno T (Tag), en lugar del complejo CMG del huésped, sirve como helicasa de ADN replicante, y la ADN polimerasa delta sintetiza tanto las hebras de ADN principales como las rezagadas32. Hemos aprovechado este sistema colocando tramos patogénicos de repeticiones formadoras de estructuras aguas abajo de un origen de replicación SV40 dentro de un plásmido que se creó originalmente en el laboratorio de Massimo Lopes22. Es importante destacar que este plásmido también contiene el gen que codifica para el propio Tag, lo que resulta en su replicación constitutiva y extremadamente potente tras la transfección en una variedad de células humanas cultivadas. Esta característica da lugar a una gran cantidad de productos, ideales para el análisis 2DGE de los intermedios formados durante y en respuesta a la replicación de repeticiones patógenas en células humanas. Aquí, describimos un método detallado para visualizar la replicación de repeticiones formadoras de estructuras dentro del episoma humano basado en SV40 utilizando electroforesis en gel bidimensional.
2DGE proporciona una imagen semicuantitativa y completa de las poblaciones relativas de intermedios que surgen durante la replicación de una secuencia particular. Dado que las frágiles estructuras moleculares de las horquillas de replicación deben mantenerse durante todo este procedimiento, se debe tener mucho cuidado para evitar el cizallamiento físico y la desnaturalización química. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente evitar cualquier tratamiento alcalino durante el aisla…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Jorge Cebrian y Anastasia Rastokina que comenzaron a desarrollar este enfoque en nuestro laboratorio, a Massimo Lopes por proporcionarnos el plásmido pML113 y consejos invaluables, a Ylli Doksani por las discusiones perspicaces y a los miembros del laboratorio Mirkin por su apoyo. El trabajo en el laboratorio de Mirkin cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [R35GM130322] y NSF-BSF [2153071].
10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Additional restriction enzymes will need to be purchased as well |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |