בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר
Summary
כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.
Abstract
ראיות מצטברות מצביעות על כך שהתגובה החיסונית המופעלת על ידי הפרעות מוחיות (למשל, איסכמיה מוחית ואנצפלומיאליטיס אוטואימונית) מתרחשת לא רק במוח, אלא גם בגולגולת. צעד מפתח לקראת ניתוח שינויים באוכלוסיית תאי מערכת החיסון במוח ובמח עצם הגולגולת לאחר נזק מוחי (למשל, שבץ) הוא להשיג מספר מספיק של תאי חיסון איכותיים לניתוחים במורד הזרם. כאן, שני פרוטוקולים אופטימליים מסופקים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. היתרונות של שני הפרוטוקולים באים לידי ביטוי בפשטותם, במהירותם וביעילותם בהפקת כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא. תאים אלה עשויים להתאים למגוון יישומים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ציטומטריית זרימה וניתוח תעתוק. כדי להדגים את יעילות הפרוטוקולים, בוצעו ניסויים אימונופנוטיפיים במוחות שבץ מוחי ובמח עצם גולגולת תקין באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, והתוצאות תאמו את ממצאי המחקרים שפורסמו.
Introduction
המוח, המרכז המרכזי של מערכת העצבים, מוגן על ידי הגולגולת. מתחת לגולגולת שלוש שכבות של רקמת חיבור הידועות בשם קרומי המוח – דורה מאטר, מאטר ארכנואיד ופיה מאטר. נוזל מוחי שדרתי (CSF) מסתובב בחלל התת עכבישי בין המאטר הארכנואיד לבין פיאה מאטר, מרפד את המוח וגם מסלק פסולת דרך המערכת הגלימפטית 1,2. יחד, ארכיטקטורה ייחודית זו מספקת סביבה בטוחה ותומכת השומרת על יציבות המוח ומגינה עליו מפני פגיעה פוטנציאלית.
המוח נחשב כבר מזמן לחסינות-פריבילגית. עם זאת, רעיון זה נזנח חלקית מכיוון שראיות מצטברות מצביעות על כך שבנוסף לתאי מיקרוגליה בפרנכימה, גבולות המוח, כולל מקלעת הכורואיד וקרומי המוח, מארחים מערך מגוון של תאי חיסון3. תאים אלה ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס, שמירה על בריאות המוח וייזום התגובה החיסונית לפגיעה מוחית. יש לציין כי ממצאים אחרונים מצביעים על כך שהגולגולת מעורבת בחסינות קרומי המוח, ועשויה לתרום לתגובה החיסונית במוח לאחר פציעה. בשנת 2018, הריסון ועמיתיו גילו תגלית ראשונית של תעלות כלי דם ישירות המקשרות את מח עצם הגולגולת לקרומי המוח, ובכך ביססו נתיב אנטומי לנדידת לויקוציטים 4,5. מאוחר יותר, Cugurra et al. הראו כי תאים מיאלואידים רבים (למשל, מונוציטים ונויטרופילים) ותאי B בקרומי המוח אינם מקורם בדם6. באמצעות טכניקות כגון השתלת עצם קלבריה ומשטרי הקרנה סלקטיבית, המחברים סיפקו ראיות משכנעות לכך שמח עצם הגולגולת משמש כמקור מקומי לתאים מיאלואידים בקרומי המוח, כמו גם פרנכימה CNS לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית6. יתר על כן, מחקר אחר הציע כי תאי B של קרום המוח מסופקים כל הזמן על ידי מח עצםהגולגולת 7. לאחרונה, מבנה חדש, המכונה יציאת השרוול הארכנואידית (ACE), זוהה כשער ישיר בין הדורה מאטר למוח לסחר בתאי מערכת החיסון8.
לממצאים מרגשים אלה יש השלכות חשובות על מקור החדירה של תאי מערכת החיסון למוח הפגוע (למשל, לאחר שבץ איסכמי). עדויות רבות מצביעות על כך שלאחר שבץ, תאי חיסון רבים חודרים למוח, מה שתורם הן לנזק מוחי חריף והן להתאוששות מוחית כרונית. הרעיון המקובל הוא שתאים אלה מזרימים לויקוציטים בדם החודרים למוח, מה שמתאפשר במידה רבה על ידי נזק למחסום הדם-מוח שנגרם כתוצאה משבץ. עם זאת, רעיון זה אותגר. במחקר אחד, תאי מערכת החיסון בגולגולת ובשוקה של עכברים תויגו באופן שונה, ולאחר 6 שעות לאחר שבץ נמצאה ירידה משמעותית גדולה יותר בנויטרופילים ומונוציטים בגולגולת לעומת . הטיביה, ונויטרופילים נוספים שמקורם בגולגולת היו נוכחים במוח האיסכמי. נתונים אלה מצביעים על כך שבשלב השבץ החריף, נויטרופילים במוח האיסכמי מקורם בעיקר במח עצםהגולגולת 4. מעניין, CSF עשוי להנחות הגירה זו. ואכן, שני דיווחים אחרונים הראו כי CSF יכול להעביר ישירות רמזי איתות מהמוח לתוך מח עצם הגולגולת דרך תעלות גולגולת, ולהורות נדידת תאים והמטופויזה במח עצם הגולגולת לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית 9,10.
לאור ממצאים עדכניים אלה, נעשה חשוב לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון הן במוח והן במוח עצם הגולגולת, כאשר חוקרים את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות. בחקירות כאלה, יש צורך במספר מספיק של תאי חיסון באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ניתוח ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). כאן, המטרה הכוללת היא להציג שני הליכים אופטימליים להכנת תרחיפים חד-תאיים מרקמת המוח ומח עצם הגולגולת. חשוב לציין כי הקלבריה (עצם קדמית, עצם עורפית ועצמות קודקודיות) של הגולגולת משמשות בדרך כלל לחילוץ מח עצם, ומח עצם זה מכונה באופן ספציפי מח עצם גולגולת במהלך מחקר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מוצגים שני פרוטוקולים פשוטים אך יעילים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. פרוטוקולים אלה יכולים להניב באופן אמין כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא שעשויים להתאים ליישומים מגוונים במורד הזרם, במיוחד עבור ציטומטריית זרימה.
כדי לחקור דלקת עצבית בהפרעות מוח ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקתי גייג’ על תרומתה המצוינת לעריכה. דמויות האיור נוצרו באמצעות BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי קרנות מהמחלקה להרדמה (המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק) ומענקים של NIH NS099590, HL157354 ו-NS127163.
Materials
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-well V-bottom microplate | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA flow cytometer | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 dilution |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 dilution |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 dilution |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 dilution |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 dilution |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 dilution |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 dilution |
| Cell Strainer 70 um | Avantor | 732-2758 | |
| Dressing Forceps | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| Forceps | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 dilution |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 dilution |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 dilution |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 dilution |
| Percoll (density gradient medium) | Cytiva | 17089101 | |
| Phosphate buffer saline (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Scissors | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size | DWK Life Sciences | 357544 |
Referenzen
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987 (2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
- Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain’s borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
- Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
- Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
- Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), eabf7844 (2021).
- Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), eabf9277 (2021).
- Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
- Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
- Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
- Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340 (2023).
- Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142 (2021).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
- Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
- Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. 108, e53658 (2016).
- Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods’ evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976 (2022).
- Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. 159, e61166 (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
- Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948 (2021).
- Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125 (2023).
- Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272 (2023).
- Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119 (2023).
- Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50 (2018).
