Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo
Summary
Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell’analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.
Abstract
Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l’analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l’analisi trascrittomica. Per dimostrare l’efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l’analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.
Introduction
Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l’aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l’aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico 1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.
Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie3. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell’avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell’immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti 4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue6. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC6. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio7. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie8.
Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l’origine dell’infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l’ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L’idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall’ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall’ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all’ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio4. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l’emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC 9,10.
Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l’analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l’obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.
Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervel…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Kathy Gage per il suo eccellente contributo editoriale. Le figure illustrative sono state create con BioRender.com. Questo studio è stato supportato da fondi del Dipartimento di Anestesiologia (Duke University Medical Center) e da sovvenzioni NIH NS099590, HL157354 e NS127163.
Materials
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-well V-bottom microplate | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA flow cytometer | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 dilution |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 dilution |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 dilution |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 dilution |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 dilution |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 dilution |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 dilution |
| Cell Strainer 70 um | Avantor | 732-2758 | |
| Dressing Forceps | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| Forceps | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 dilution |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 dilution |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 dilution |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 dilution |
| Percoll (density gradient medium) | Cytiva | 17089101 | |
| Phosphate buffer saline (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Scissors | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size | DWK Life Sciences | 357544 |
Referenzen
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