Эффективный подход к трансгенезу для доставки генов в эмбриональное сердце мыши

Сердце – это первый орган, который формируется во время эмбрионального развития. Этот процесс включает в себя пространственно-временную координацию различных популяций клеток-предшественников из различных областей эмбриона. Все это происходит в то время, когда развивающееся сердце продолжает биться и функционировать, подчеркивая замечательную координацию, необходимую для его формирования ^1,2,3. Учитывая решающую роль сердца, строгая регуляция на клеточном и молекулярном уровнях имеет важное значение для его правильного формирования ^4,5. Выявление механизмов, контролирующих развитие сердца, представляет большой интерес, поскольку они имеют решающее значение для раскрытия врожденных пороков сердца, которые поражают значительное число^{пациентов во всем} мире. Кроме того, понимание развития сердца имеет решающее значение для расшифровки регенерации сердца, поскольку послеродовое сердце млекопитающих сохраняет регенеративную способность, которая теряется или затрудняется во взрослом ^{возрасте.} Следовательно, препарирование молекулярных регуляторов развития сердца является обязательным условием для продвижения исследований врожденных пороков сердца и регенерации сердца.

В стремлении к достижению этой цели все большее внимание уделяется исследованию роли эпикарда в развитии и регенерации сердца⁹. Эпикард представляет собой тонкий слой мезотелиальной ткани, который составляет самый внешний слой сердца млекопитающих (Рисунок 1). Недавние исследования показали важность эпикарда при повреждении сердца, показав, что эта ткань способна посылать сигналы пролиферации кардиомиоцитам в пораженной области, чтобы смягчить повреждение^10,11. Несмотря на важность эпикарда, проведение дальнейших молекулярных исследований было затруднено из-за его огромной гетерогенности. Эксперименты с РНК одиночных клеток выявили гетерогенность эпикарда, содержащего несколько клеточных субпопуляций с различными транскриптомными сигнатурами 12,13,14,15,16. Таким образом, стратегия скрининга потенциальных регуляторов сердечного развития должна учитывать разнообразие эпикардиальных клеток-предшественников.

В этом смысле способность мышиной модели к генетической модификации способствовала идентификации многочисленных генов, имеющих решающее значение для развития сердца, что позволило создать мутантные линии с усилением функции (GOF) или потерей функции (LOF) определенных генов. Однако такие подходы предполагают значительные вложения времени и экспериментальных ресурсов; Поэтому они непрактичны при оценке роли большого числа генов-кандидатов. Кроме того, гены развития часто проявляют плейотропные функции в различных тканях или необходимы для раннего эмбрионального развития, что затрудняет интерпретацию их вклада в развитие в конкретном процессе. Несмотря на то, что можно нацелить функцию гена на определенные структуры или временные точки развития, это обычно требует использования более сложных генетических конструкций, которые может быть трудно создать или которые вообще недоступны.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы представляем методологию электропорации эмбриональных сердец мышей для транзиторного трансгенеза (рис. 2). В сочетании с культурой ex vivo и флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS) эта стратегия демонстрирует свои возможности через транзиторный GOF Meis1, хорошо охарактеризованный ген, участвующий в развитии и регенерации сердца 17,18,19. В данной статье также исследуются другие потенциальные применения этой методологии, а также обсуждаются ее преимущества и ограничения, а также сравнение с существующими протоколами для транзиторной модуляции экспрессии генов. Мы считаем, что представленная структура и наглядные примеры улучшат понимание биологии эпикарда во время развития и болезни.

Рисунок 1: Эмбриональные слои сердца мыши. Принципиальная схема коронального изображения эмбрионального сердца мыши E13-14. Три основных клеточных слоя сердца представлены желтым (эндокард), красным (миокард) и синим (эпикардом) цветом. Перикард представлен коричневой линией. Четыре камеры сердца сокращенно обозначаются как ЛЖ – левый желудочек; ПЖ, правый желудочек; Лос-Анджелес, левое предсердие; РА, правое предсердие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Схематический обзор протокола электропорации сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.