גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

הלב הוא האיבר הראשון שנוצר במהלך ההתפתחות העוברית. תהליך זה כרוך בתיאום מרחבי-זמני של אוכלוסיות שונות של תאי אב מאזורים שונים של העובר. כל זה קורה בזמן שהלב המתפתח ממשיך לפעום ולתפקד, תוך הדגשת הקואורדינציה יוצאת הדופן הנדרשת להיווצרותו ^1,2,3. בהתחשב בתפקיד המכריע של הלב, ויסות הדוק ברמה התאית והמולקולרית חיוני להיווצרותו התקינה ^4,5. זיהוי המנגנונים השולטים בהתפתחות הלב מעורר עניין רב, שכן הם חיוניים לפענוח הפרעות לב מולדות, המשפיעות על מספר ניכר של חולים ברחבי העולם⁶. יתר על כן, הבנת התפתחות הלב היא חיונית בפענוח התחדשות הלב, שכן לבבות יונקים לאחר לידה שומרים על יכולת התחדשות שאובדת או מעוכבת בבגרות ^7,8. כתוצאה מכך, ניתוח הרגולטורים המולקולריים של התפתחות הלב הוא הכרחי כדי לקדם את מאמצי המחקר על מחלות לב מולדות והתחדשות לב.

במרדף אחר מטרה זו, יש התמקדות הולכת וגוברת בחקירת תפקידו של האפיקרדיום בהתפתחות הלב^{והתחדשות 9}. האפיקרדיום הוא שכבה דקה של רקמה מזותלית שמהווה את השכבה החיצונית ביותר של לב היונקים (איור 1). מחקרים אחרונים הראו את חשיבותו של אפיקרדיום במהלך פגיעה לבבית, וחשפו כי רקמה זו מסוגלת לשלוח אותות התפשטות לקרדיומיוציטים באזור הפגוע כדי למתן את הנזק^10,11. למרות חשיבותו של אפיקרדיום, ביצוע חקירות מולקולריות נוספות אותגר על ידי ההטרוגניות העצומה שלו. ניסויי RNAseq חד-תאיים חשפו את ההטרוגניות של האפיקרדיום, המאכלס תת-אוכלוסיות תאים מרובות עם חתימות שעתוק ברורות 12,13,14,15,16. לפיכך, אסטרטגיה לסינון רגולטורים פוטנציאליים של התפתחות הלב צריכה להתאים למגוון תאי האב האפיקרדיאליים.

במובן זה, ההתאמה של מודל העכבר לשינוי גנטי הקלה על זיהוי גנים רבים החיוניים להתפתחות הלב, ואפשרה יצירת קווים מוטנטיים עם רווח של תפקוד (GOF) או אובדן תפקוד (LOF) של גנים ספציפיים. עם זאת, גישות אלה מרמזות על השקעה ניכרת של זמן ומשאבים ניסיוניים; לכן, הם אינם מעשיים בעת הערכת תפקידיהם של מספר רב של גנים מועמדים. מלבד זאת, גנים התפתחותיים לעיתים קרובות מפעילים פונקציות פליוטרופיות ברקמות שונות או נדרשים להתפתחות עוברית מוקדמת, מה שפוגע בפרשנות תרומתם להתפתחות בתהליך מסוים. בעוד שניתן לכוון את תפקוד הגנים במבנים ספציפיים או בנקודות זמן התפתחותיות, זה בדרך כלל דורש שימוש במבנים גנטיים מורכבים יותר, אשר יכולים להיות קשים ליצירה או שאינם זמינים בדרך כלל.

כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנו מציגים מתודולוגיה לאלקטרופורציה של לבבות עובריים של עכברים עבור טרנסגנזה חולפת (איור 2). בשילוב עם תרבית ex vivo ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), אסטרטגיה זו מדגימה את יכולותיה באמצעות GOF חולף של Meis1, גן מאופיין היטב המעורב בהתפתחות לב^{והתחדשות 17,18,19}. במאמר זה נחקרים גם יישומים פוטנציאליים אחרים של מתודולוגיה זו, ונדונים יתרונותיה ומגבלותיה, וכן בהשוואה לפרוטוקולים קיימים לוויסות זמני של ביטוי גנים. אנו מאמינים שהמסגרת והדוגמאות החזותיות שהוצגו ישפרו את ההבנה של ביולוגיה של אפיקרדיום במהלך התפתחות ומחלות.

איור 1: שכבות לב עובריות של עכברים. תרשים סכמטי של תצוגה קורונלית של לב עוברי עכבר E13-14. שלוש השכבות התאיות העיקריות של הלב מיוצגות בצהוב (אנדוקרדיום), אדום (שריר הלב) וכחול (אפיקרדיום). קרום הלב מיוצג בקו חום. ארבעת חדרי הלב מקוצרים כ-LV, החדר השמאלי; RV, החדר הימני; לוס אנג’לס, אטריום שמאלי; RA, אטריום ימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סקירה סכמטית של פרוטוקול אלקטרופורציה של הלב. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.