마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

심장은 배아 발달 과정에서 형성되는 첫 번째 기관입니다. 이 과정에는 배아의 뚜렷한 영역에서 온 전구 세포의 다양한 집단의 시공간 조정이 포함됩니다. 이 모든 것은 발달 중인 심장이 계속 뛰고 기능하는 동안 발생하며, 심장 형성에 필요한 놀라운 조정이 강조됩니다 ^1,2,3. 심장의 중요한 역할을 감안할 때, 세포 및 분자 수준에서의 엄격한 조절은 심장의 적절한 형성을 위해 필수적입니다 ^4,5. 심장 발달을 조절하는 메커니즘을 규명하는 것은 전 세계적으로 상당한 수의 환자에게 영향을 미치는 선천성 심장 질환을 밝히는 데 중요하기 때문에 매우 흥미롭습니다⁶. 또한, 출생 후 포유류의 심장은 성인기에 상실되거나 방해받은 재생 능력을 유지하기 때문에 심장 발달을 이해하는 것은 심장 재생을 해독하는 데 중추적인 역할을 합니다 ^7,8. 따라서 심장 발달의 분자 조절 인자를 해부하는 것은 선천성 심장 질환 및 심장 재생에 대한 연구 노력을 발전시키는 데 필수적입니다.

이 목표를 달성하기 위해 심장 발달 및 재생에서 심외막의 역할을 조사하는 데 점점 더 많은 관심이 쏠리고 있다⁹. 심외막은 포유류 심장의 가장 바깥층을 구성하는 중피 조직의 얇은 층입니다(그림 1). 최근 연구에 따르면 심장 손상 중 심외막의 중요성이 밝혀졌으며, 이 조직이 영향을 받는 부위의 심근세포에 증식 신호를 보내 손상을 완화할 수 있음을 밝혔습니다^10,11. 심외막의 중요성에도 불구하고 추가적인 분자 연구를 수행하는 것은 엄청난 이질성으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 단일 세포 RNAseq 실험은 뚜렷한 전사체 서명 12,13,14,15,16을 가진 여러 세포 하위 집단을 수용하는 심외막의 이질성을 밝혀냈습니다. 따라서, 심장 발달의 잠재적 조절자를 스크리닝하는 전략은 심외막 전구 세포의 다양성을 수용해야 합니다.

이러한 의미에서 유전자 변형에 대한 마우스 모델의 적합성은 심장 발달에 중요한 수많은 유전자의 식별을 용이하게 하여 특정 유전자의 GOF(Gain-of-Function) 또는 LOF(Loss-of-Function)를 가진 돌연변이 계통의 생성을 가능하게 했습니다. 그러나 이러한 접근 방식은 상당한 시간과 실험 자원의 투자를 의미합니다. 따라서 많은 수의 후보 유전자의 역할을 평가할 때 실용적이지 않습니다. 게다가, 발달 유전자는 종종 다른 조직에서 다원성 기능을 발휘하거나 초기 배아 발달에 필요하여 특정 과정에서 발달에 대한 기여도를 해석하는 데 어려움을 겪습니다. 특정 구조나 발달 시점에서 유전자 기능을 표적으로 삼는 것이 가능하지만, 이를 위해서는 일반적으로 생성하기 어렵거나 일반적으로 사용할 수 없는 더 복잡한 유전자 구조를 사용해야 합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 일시적인 유전자 변형을 위해 쥐 배아 심장을 전기화하는 방법론을 제시합니다(그림 2). 체외 배양 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 결합된 이 전략은 심장 발달 및 재생에 관여하는 잘 특성화된 유전자인 Meis1의 일시적인 GOF를 통해 그 능력을 입증합니다 17,18,19. 이 기사에서는 이 방법론의 다른 잠재적 응용 분야도 살펴보고, 장점과 한계에 대해 논의하며, 유전자 발현을 일시적으로 조절하기 위한 기존 프로토콜과 비교합니다. 우리는 제시된 프레임워크와 시각적 예가 발달 및 질병 중 심외막 생물학에 대한 이해를 향상시킬 것이라고 믿습니다.

그림 1: 쥐의 배아 심장층. E13-14 쥐 배아 심장의 관상도 개략도. 심장의 세 가지 주요 세포층은 노란색(심내막), 빨간색(심근), 파란색(심외막)으로 표시됩니다. 심낭은 갈색 선으로 표시됩니다. 심장의 4 개의 방은 좌심실, LV 로 약칭됩니다. RV, 우심실; LA, 왼쪽 심방; RA, 우심방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 심장 전기천공법 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.