マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

心臓は、胚発生中に形成される最初の器官です。このプロセスには、胚の異なる領域から得られる前駆細胞のさまざまな集団の時空間的な調整が含まれます。これらはすべて、発達中の心臓が鼓動し、機能し続ける間に起こり、その形成に必要な顕著な協調性が強調されています^1,2,3。心臓の重要な役割を考えると、細胞レベルおよび分子レベルでの厳密な制御は、その適切な形成に不可欠です^4,5。心臓の発達を制御するメカニズムを特定することは、世界中のかなりの数の患者に影響を与える先天性心疾患の解明に不可欠であるため、非常に興味深いものでした⁶。さらに、出生後の哺乳類の心臓は、成人期に失われたり妨げられたりする再生能力を保持しているため、心臓の発達を理解することは心臓の再生を解読する上で極めて重要です^7,8。したがって、先天性心疾患と心臓再生に関する研究を進めるためには、心臓発生の分子調節因子を解剖することが不可欠です。

この目的を追求するために、心臓の発達と再生における心外膜の役割を調査することにますます注目が集まっています⁹。心外膜は、哺乳類の心臓の最外層を構成する中皮組織の薄い層です(図1)。最近の研究では、心臓損傷時の心外膜の重要性が示されており、この組織が患部の心筋細胞に増殖シグナルを送信して損傷を軽減できることが明らかになっています^10,11。心外膜の重要性にもかかわらず、さらなる分子研究を行うことは、その巨大な不均一性によって課題とされてきました。シングルセルRNAseq実験により、心外膜の不均一性が明らかになり、異なるトランスクリプトームシグネチャ12,13,14,15,16を持つ複数の細胞亜集団が収容されています。したがって、心臓発生の潜在的な調節因子をスクリーニングする戦略は、心外膜前駆細胞の多様性に対応する必要があります。

この意味で、マウスモデルの遺伝子改変に対する適合性は、心臓の発達に不可欠な多数の遺伝子の同定を容易にし、特定の遺伝子の機能獲得(GOF)または機能喪失(LOF)を持つ変異株の生成を可能にしました。ただし、これらのアプローチは、時間と実験リソースのかなりの投資を意味します。したがって、多数の候補遺伝子の役割を評価する際には実用的ではありません。さらに、発生遺伝子は、多くの場合、さまざまな組織で多面的な機能を発揮したり、初期の胚発生に必要とされたりするため、特定のプロセスでの発生への貢献の解釈を妨げます。特定の構造や発生時点で遺伝子機能を標的とすることは可能ですが、これには通常、より複雑な遺伝子構造の使用が必要であり、生成が困難であったり、一般的に利用できなかったりします。

これらの制限を克服するために、一過性トランスジェネシスのためにマウス胚の心臓をエレクトロポレートする方法を提示します(図2)。ex vivo培養および蛍光活性化セルソーティング(FACS)と組み合わせることで、この戦略は、心臓の発生と再生に関与する十分に特徴付けられた遺伝子であるMeis1の一過性GOFを通じてその能力を実証します17,18,19。この記事では、この方法論の他の潜在的なアプリケーションについても検討し、その利点と限界、および遺伝子発現を一過性に調節するための既存のプロトコルとの比較について説明します。提示されたフレームワークと視覚的な例は、発生および疾患中の心外膜生物学の理解を深めると信じています。

図1:マウスの胚の心臓層。 E13-14マウス胚の心臓の冠状図の概略図。心臓の3つの主要な細胞層は、黄色(心内膜)、赤(心筋)、青(心外膜)で表されます。心膜は茶色の線で表されます。心臓の4つの心室は 、LV、 左心室と略されます。 RV、 右心室; LA、 左心房; RA、 右心房。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:心臓エレクトロポレーションプロトコルの概略図の概要。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。