该协议为发育中的小鼠心脏中基于电穿孔的心肌细胞转基因提供了详细的方法框架。此处提供的视频资源将有助于学习这种通用技术。
哺乳动物心脏是一个复杂的器官,在发育过程中 通过 高度多样化的祖细胞群形成。这些祖先的起源、招募时间和命运对于该器官的正常发育至关重要。控制心脏形态发生的分子机制对于理解先天性心脏病和胚胎心脏再生的发病机制至关重要。研究这些机制的经典方法采用转基因小鼠的产生来评估心脏发育过程中特定基因的功能。然而,小鼠转基因是一个复杂、耗时的过程,通常无法评估特定基因在心脏发育过程中的作用。为了解决这个问题,我们开发了一种小鼠胚胎心脏高效电穿孔和培养的方案,使瞬时转基因能够快速评估参与心脏发育的基因功能获得或丧失的影响。使用这种方法,我们成功地在胚胎心脏中过表达 Meis1,并优先进行心外膜细胞转染,证明了该技术的能力。
心脏是胚胎发育过程中形成的第一个器官。这个过程涉及来自胚胎不同区域的各种祖细胞群的时空协调。所有这一切都是在发育中的心脏继续跳动和功能的同时发生的,强调了其形成所需的非凡协调性 1,2,3。鉴于心脏的关键作用,细胞和分子水平的严格调节对于心脏的正常形成至关重要 4,5。确定控制心脏发育的机制一直非常有趣,因为它们对于解开先天性心脏病至关重要,先天性心脏病影响着全世界的大量患者6。此外,理解心脏发育对于破译心脏再生至关重要,因为出生后哺乳动物的心脏保留了在成年后丢失或受阻的再生能力 7,8。因此,剖析心脏发育的分子调节因子对于推进先天性心脏病和心脏再生的研究工作至关重要。
为了实现这一目标,人们越来越关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用9。心外膜是一层薄薄的间皮组织,构成哺乳动物心脏的最外层(图 1)。最近的研究表明心外膜在心脏损伤期间的重要性,表明该组织能够向受影响区域的心肌细胞发送增殖信号以减轻损伤10,11。尽管心外膜很重要,但进行进一步的分子研究一直受到其巨大异质性的挑战。单细胞 RNAseq 实验揭示了心外膜的异质性,包含具有不同转录组特征的多个细胞亚群12、13、14、15、16。因此,筛选心脏发育潜在调节因子的策略应适应心外膜祖细胞的多样性。
从这个意义上说,小鼠模型对基因改造的适应性促进了对心脏发育至关重要的许多基因的鉴定,从而可以产生具有特定基因功能获得 (GOF) 或功能丧失 (LOF) 的突变系。然而,这些方法意味着大量的时间和实验资源的投入;因此,在评估大量候选基因的作用时,它们是不切实际的。此外,发育基因通常在不同的组织中发挥多效性功能,或者是早期胚胎发育所必需的,从而阻碍了对它们在特定过程中对发育的贡献的解释。虽然可以在特定结构或发育时间点靶向基因功能,但这通常需要使用更复杂的遗传结构,这可能难以生成或通常不可用。
为了克服这些限制,我们提出了一种对小鼠胚胎心脏进行电穿孔以进行瞬时转基因的方法(图 2)。与离体培养和荧光激活细胞分选 (FACS) 配合使用,该策略通过 Meis1 的瞬时 GOF 展示其能力,Meis1 是一种与心脏发育和再生有关的特征明确的基因 17,18,19。在本文中,还探讨了该方法的其他潜在应用,并讨论了其优点和局限性,以及与瞬时调节基因表达的现有方案的比较。我们相信所提出的框架和视觉示例将增强对发育和疾病过程中心外膜生物学的理解。
图 1:小鼠胚胎心脏层。 E13-14 小鼠胚胎心脏的冠状图示意图。心脏的三个主要细胞层以黄色(心内膜)、红色(心肌)和蓝色(心外膜)表示。心包用棕色线表示。心脏的四个腔室缩写为 LV, 左心室; RV, 右心室; LA, 左心房; RA, 右心房。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:心脏电穿孔方案的示意图概述。请单击此处查看此图的较大版本。
总体而言,此处描述的方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个强大的框架(图 4B),如 Meis1 过表达所示(图 4C)。通过适当的构建体,该方案可用于瞬时评估特定基因的功能获得 (GOF) 或功能丧失 (LOF) 的影响。LOF可以通过 RNA 干扰转染靶向候选基因的质粒来实施到该技术中 26。基因 GOF 或 LOF 的快速评估特别有?…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了西班牙科学和创新部的 RTI2018-097617-J-I00 和哈恩大学的 Acción 9 资助 O.H.O. 的资助 PGC2018-096486-B-I00 来自西班牙科学和创新部的资助 -096486-B-I00 和欧盟地平线 2020 计划向 MT 提供的 H2020-MSCA-ITN-2016-722427 资助 MT JMG 得到了西班牙科学部和塞韦罗奥乔亚基金会 (PRE2022-101884) 的博士奖学金的支持。CNIC 和 CBMSO 都得到了西班牙科学部的支持,CNIC 得到了 ProCNIC 基金会的支持。
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
Distilled water | |||
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
Liberase | Roche | 5401119001 | |
Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
Phenol Red | Merck | P3532 | |
Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
Sucrose | Millipore | 84100 | |
Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
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