Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Das Herz ist das erste Organ, das während der Embryonalentwicklung gebildet wird. Dieser Prozess beinhaltet die räumlich-zeitliche Koordination verschiedener Populationen von Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos. All dies geschieht, während das sich entwickelnde Herz weiter schlägt und funktioniert, was die bemerkenswerte Koordination unterstreicht, die für seine Bildung erforderlich ist ^1,2,3. Angesichts der entscheidenden Rolle des Herzens ist eine strenge Regulierung auf zellulärer und molekularer Ebene für seine ordnungsgemäße Bildung unerlässlich ^4,5. Die Identifizierung der Mechanismen, die die Herzentwicklung steuern, war von großem Interesse, da sie für die Entschlüsselung angeborener Herzfehler von entscheidender Bedeutung sind, von denen eine beträchtliche Anzahl von Patienten weltweit betroffen ist⁶. Darüber hinaus ist das Verständnis der Herzentwicklung entscheidend für die Entschlüsselung der kardialen Regeneration, da postnatale Säugetierherzen eine Regenerationsfähigkeit behalten, die im Erwachsenenalter verloren geht oder behindert wird ^7,8. Daher ist die Entschlüsselung molekularer Regulatoren der Herzentwicklung unerlässlich, um die Forschung zu angeborenen Herzfehlern und Herzregeneration voranzutreiben.

Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die Rolle des Epikards bei der kardialen Entwicklung und Regeneration zunehmend in den Fokus gerückt⁹. Das Epikard ist eine dünne Schicht aus mesothelialem Gewebe, die die äußerste Schicht des Säugetierherzens bildet (Abbildung 1). Jüngste Studien haben die Bedeutung des Epikards bei Herzverletzungen gezeigt und gezeigt, dass dieses Gewebe in der Lage ist, Proliferationssignale an Kardiomyozyten im betroffenen Bereich zu senden, um den Schaden zu mildern^10,11. Trotz der Bedeutung des Epikards wurde die Durchführung weiterer molekularer Untersuchungen durch seine immense Heterogenität erschwert. Einzelzell-RNAseq-Experimente haben die Heterogenität des Epikards gezeigt, das mehrere Zellsubpopulationen mit unterschiedlichen transkriptomischen Signaturen beherbergt 12,13,14,15,16. Daher sollte eine Strategie zum Screening potenzieller Regulatoren der kardialen Entwicklung die Vielfalt der epikardialen Vorläuferzellen berücksichtigen.

In diesem Sinne hat die Zugänglichkeit des Mausmodells für genetische Veränderungen die Identifizierung zahlreicher Gene erleichtert, die für die Herzentwicklung entscheidend sind, und die Erzeugung von Mutantenlinien mit Funktionsgewinn (GOF) oder Funktionsverlust (LOF) spezifischer Gene ermöglicht. Diese Ansätze erfordern jedoch einen erheblichen Aufwand an Zeit und experimentellen Ressourcen; Daher sind sie unpraktisch, wenn es darum geht, die Rolle einer großen Anzahl von Kandidatengenen zu beurteilen. Darüber hinaus üben Entwicklungsgene oft pleiotrope Funktionen in verschiedenen Geweben aus oder werden für die frühe Embryonalentwicklung benötigt, was die Interpretation ihres Beitrags zur Entwicklung in einem bestimmten Prozess erschwert. Es ist zwar möglich, die Genfunktion zu bestimmten Strukturen oder Zeitpunkten der Entwicklung zu steuern, aber dies erfordert in der Regel die Verwendung komplexerer genetischer Konstruktionen, die schwer zu generieren oder im Allgemeinen nicht verfügbar sind.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Elektroporation embryonaler Mausherzen für die transiente Transgenese vor (Abbildung 2). In Kombination mit ex vivo-Kultur und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) demonstriert diese Strategie ihre Fähigkeiten durch die transiente GOF von Meis1, einem gut charakterisierten Gen, das an der Herzentwicklung und -regeneration beteiligt ist 17,18,19. In diesem Artikel werden auch andere potenzielle Anwendungen dieser Methodik untersucht, ihre Vorteile und Grenzen diskutiert sowie mit bestehenden Protokollen zur transienten Modulation der Genexpression verglichen. Wir glauben, dass der Rahmen und die vorgestellten visuellen Beispiele das Verständnis der Epikardbiologie während der Entwicklung und Krankheit verbessern werden.

Abbildung 1: Embryonale Herzschichten der Maus. Schematische Darstellung einer koronalen Ansicht eines embryonalen Herzens einer E13-14-Maus. Die drei Hauptzellschichten des Herzens werden in Gelb (Endokard), Rot (Myokard) und Blau (Epikard) dargestellt. Das Perikard ist in einer braunen Linie dargestellt. Die vier Kammern des Herzens werden als LV, linker Ventrikel, abgekürzt; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechter Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Übersicht des Herzelektroporationsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.