Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen
Summary
Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.
Abstract
Het hart van zoogdieren is een complex orgaan dat tijdens de ontwikkeling wordt gevormd via zeer diverse populaties van voorlopercellen. De oorsprong, het tijdstip van rekrutering en het lot van deze voorouders zijn van vitaal belang voor de goede ontwikkeling van dit orgaan. De moleculaire mechanismen die de morfogenese van het hart bepalen, zijn essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van aangeboren hartaandoeningen en embryonale hartregeneratie. Klassieke benaderingen om deze mechanismen te onderzoeken, gebruikten de generatie van transgene muizen om de functie van specifieke genen tijdens de cardiale ontwikkeling te beoordelen. Transgenese van muizen is echter een complex, tijdrovend proces dat vaak niet kan worden uitgevoerd om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van het hart te beoordelen. Om dit aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld voor efficiënte elektroporatie en kweek van embryonale harten van muizen, waardoor transiënte transgenese snel het effect van functiewinst of functieverlies van genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van het hart kan beoordelen. Met behulp van deze methodologie hebben we Meis1 met succes tot overexpressie gebracht in het embryonale hart, met een voorkeur voor epicardiale celtransfectie, wat de mogelijkheden van de techniek aantoont.
Introduction
Het hart is het eerste orgaan dat tijdens de embryonale ontwikkeling wordt gevormd. Dit proces omvat de spatiotemporele coördinatie van verschillende populaties voorlopercellen uit verschillende delen van het embryo. Dit alles gebeurt terwijl het zich ontwikkelende hart blijft kloppen en functioneren, met de nadruk op de opmerkelijke coördinatie die nodig is voor de vormingervan 1,2,3. Gezien de cruciale rol van het hart is een strakke regulatie op cellulair en moleculair niveau essentieel voor de juiste vorming ervan 4,5. Het identificeren van de mechanismen die de ontwikkeling van het hart regelen, is van groot belang geweest, omdat ze cruciaal zijn voor het ontrafelen van aangeboren hartaandoeningen, die een aanzienlijk aantal patiënten wereldwijdtreffen6. Bovendien is het begrijpen van de ontwikkeling van het hart cruciaal bij het ontcijferen van hartregeneratie, aangezien postnatale zoogdierharten een regeneratief vermogen behouden dat op volwassen leeftijd verloren gaat of wordt belemmerd 7,8. Daarom is het ontleden van moleculaire regulatoren van de ontwikkeling van het hart absoluut noodzakelijk om de onderzoeksinspanningen op het gebied van aangeboren hartaandoeningen en hartregeneratie te bevorderen.
Bij het nastreven van dit doel is er een groeiende focus op het onderzoeken van de rol van het epicardium in de ontwikkeling en regeneratie van het hart. Het epicardium is een dunne laag mesotheelweefsel die de buitenste laag van het hart van zoogdieren vormt (figuur 1). Recente studies hebben het belang van het epicardium tijdens hartletsel aangetoond, waaruit blijkt dat dit weefsel in staat is om proliferatiesignalen naar cardiomyocyten in het getroffen gebied te sturen om de schade te beperken10,11. Ondanks het belang van het epicardium, is het uitvoeren van verder moleculair onderzoek uitgedaagd door de immense heterogeniteit ervan. Single-cell RNAseq-experimenten hebben de heterogeniteit van het epicardium onthuld, met subpopulaties van meerdere cellen met verschillende transcriptomische handtekeningen 12,13,14,15,16. Een strategie om potentiële regulatoren van de cardiale ontwikkeling te screenen, moet dus rekening houden met de diversiteit van epicardiale voorlopercellen.
In die zin heeft de gevoeligheid van het muismodel voor genetische modificatie de identificatie van talrijke genen die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van het hart vergemakkelijkt, waardoor mutante lijnen met gain-of-function (GOF) of loss-of-function (LOF) van specifieke genen kunnen worden gegenereerd. Deze benaderingen impliceren echter een aanzienlijke investering van tijd en experimentele middelen; Daarom zijn ze onpraktisch bij het beoordelen van de rollen van een groot aantal kandidaat-genen. Bovendien oefenen ontwikkelingsgenen vaak pleiotrope functies uit in verschillende weefsels of zijn ze nodig voor de vroege embryonale ontwikkeling, waardoor de interpretatie van hun bijdrage aan de ontwikkeling in een specifiek proces wordt belemmerd. Hoewel het mogelijk is om de genfunctie te richten op specifieke structuren of ontwikkelingstijdstippen, vereist dit meestal het gebruik van complexere genetische constructies, die moeilijk te genereren kunnen zijn of over het algemeen niet beschikbaar zijn.
Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een methodologie om embryonale harten van muizen te elektropoleren voor voorbijgaande transgenese (Figuur 2). In combinatie met ex vivo-cultuur en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), demonstreert deze strategie zijn mogelijkheden door middel van voorbijgaande GOF van Meis1, een goed gekarakteriseerd gen dat betrokken is bij de ontwikkeling en regeneratie van het hart 17,18,19. In dit artikel worden ook andere mogelijke toepassingen van deze methodologie onderzocht en worden de voordelen en beperkingen ervan besproken, evenals vergeleken met bestaande protocollen voor het tijdelijk moduleren van genexpressie. Wij zijn van mening dat het gepresenteerde raamwerk en de visuele voorbeelden het begrip van de epicardiumbiologie tijdens ontwikkeling en ziekte zullen vergroten.
Figuur 1: Embryonale hartlagen van muizen. Schematisch diagram van een coronaal aanzicht van een E13-14 muisembryonaal hart. De drie belangrijkste cellulaire lagen van het hart worden weergegeven in geel (endocardium), rood (myocardium) en blauw (epicardium). Het hartzakje wordt weergegeven in een bruine lijn. De vier kamers van het hart worden afgekort als LV, linkerventrikel; RV, rechter ventrikel; LA, linker atrium; RA, rechter atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch overzicht van het hartelektroporatieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Over het algemeen biedt de hier beschreven methodologie een robuust kader voor het tot expressie brengen van transgene constructen in het zich ontwikkelende epicardium (Figuur 4B), zoals aangetoond door Meis1-overexpressie (Figuur 4C). Met de juiste constructen kan dit protocol worden gebruikt om de impact van functiewinst (GOF) of functieverlies (LOF) van een specifiek gen tijdelijk te beoordelen. LOF kan in de techniek worden geïmplementeerd door een plasmide…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidie RTI2018-097617-J-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en Acción 9 van Universidad de Jaén aan O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 van het EU Horizon 2020-programma aan MT. JMG werd ondersteund door een PhD-beurs van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Zowel de CNIC als de CBMSO worden ondersteund door het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de CNIC wordt ondersteund door de ProCNIC Foundation.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
Referenzen
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668 (2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921 (2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165 (2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. 75, e50359 (2013).
.