Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie
Summary
Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.
Abstract
Virale infecties kunnen stress bij het endoplasmatisch reticulum (ER) veroorzaken als gevolg van abnormale eiwitophoping, wat leidt tot ongevouwen eiwitrespons (UPR). Virussen hebben strategieën ontwikkeld om de UPR van de gastheer te manipuleren, maar er is een gebrek aan gedetailleerd begrip van UPR-modulatie en de functionele betekenis ervan tijdens HIV-1-infectie in de literatuur. In deze context beschrijft het huidige artikel de protocollen die in ons laboratorium worden gebruikt om ER-stressniveaus en UPR tijdens HIV-1-infectie in T-cellen te meten en het effect van UPR op virale replicatie en infectiviteit.
Thioflavine T (ThT)-kleuring is een relatief nieuwe methode die wordt gebruikt om ER-stress in de cellen te detecteren door eiwitaggregaten te detecteren. Hier hebben we het protocol geïllustreerd voor ThT-kleuring in HIV-1-geïnfecteerde cellen om ER-stress te detecteren en te kwantificeren. Bovendien werd ER-stress ook indirect gedetecteerd door het meten van de niveaus van UPR-markers zoals BiP, gefosforyleerd IRE1, PERK en eIF2α, splitsing van XBP1, splitsing van ATF6, ATF4, CHOP en GADD34 in HIV-1-geïnfecteerde cellen, met behulp van conventionele immunoblotting en kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR). We hebben ontdekt dat de ThT-fluorescentie correleert met de indicatoren van UPR-activering. Dit artikel demonstreert ook de protocollen om de impact van ER-stress en UPR-modulatie op HIV-1-replicatie te analyseren door knockdown-experimenten, evenals het gebruik van farmacologische moleculen. Het effect van UPR op HIV-1-genexpressie/replicatie en virusproductie werd geanalyseerd door respectievelijk Luciferase reporter-assays en p24-antigeen-capture ELISA, terwijl het effect op de infectiviteit van virionen werd geanalyseerd door kleuring van geïnfecteerde reportercellen. Gezamenlijk biedt deze reeks methoden een uitgebreid begrip van de ongevouwen eiwitresponsroutes tijdens HIV-1-infectie, waardoor de ingewikkelde dynamiek ervan wordt onthuld.
Introduction
Verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) wordt gekenmerkt door een geleidelijke vermindering van het aantal CD4+ T-lymfocyten, wat leidt tot het progressieve falen van de immuunrespons. Humaan immunodeficiëntievirus-1 (HIV-1) is de veroorzaker van aids. Het is een omhuld, positief sense, enkelstrengs RNA-virus met twee kopieën van RNA per virion en behoort tot de familie retroviridae. De productie van hoge concentraties virale eiwitten in de gastheercel legt overmatige druk op de eiwitvouwmachine van de cel1. ER is het eerste compartiment in de secretoire route van eukaryote cellen. Het is verantwoordelijk voor het produceren, veranderen en afleveren van eiwitten aan de secretoire route en de extracellulaire ruimtedoellocaties. Eiwitten ondergaan tal van posttranslationele veranderingen en vouwen zich in hun natuurlijke conformatie in het ER, waaronder asparagine-gekoppelde glycosylering en de vorming van intra- en intermoleculaire disulfidebindingen2. Daarom zijn er hoge concentraties eiwitten aanwezig in het ER-lumen en deze zijn zeer vatbaar voor aggregatie en misvouwing. Verschillende fysiologische omstandigheden, zoals hitteshock, microbiële of virale infecties, die een verbeterde eiwitsynthese of eiwitmutatie vereisen, leiden tot ER-stress als gevolg van verhoogde eiwitaccumulatie in het ER, waardoor de homeostase van het ER-lumen wordt verstoord. De ER-stress activeert een netwerk van sterk geconserveerde adaptieve signaaltransductieroutes, de Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR wordt gebruikt om de normale fysiologische toestand van het ER terug te brengen door de ongevouwen eiwitbelasting en het vouwvermogen op elkaar af te stemmen. Dit wordt veroorzaakt door het vergroten van de ER-grootte en ER-residente moleculaire chaperonnes en foldasen, wat resulteert in een verhoging van het vouwvermogen van de ER. UPR verlaagt ook de eiwitbelasting van het ER door wereldwijde verzwakking van de eiwitsynthese op translationeel niveau en verhoogt de klaring van ongevouwen eiwitten uit het ER door ER-geassocieerde afbraak (ERAD) te reguleren4,5.
ER-stress wordt waargenomen door drie ER-residente transmembraaneiwitten: proteïnekinase R (PKR)-achtig endoplasmatisch reticulumkinase (PERK), activerende transcriptiefactor 6 (ATF6) en inositol-vereisend enzym type 1 (IRE1). Al deze effectoren worden inactief gehouden door zich te binden aan het chaperonne Heat shock eiwit familie A (Hsp70) lid 5 (HSPA5), ook bekend als bindend eiwit (BiP)/78-kDa glucose-gereguleerd eiwit (GRP78). Bij ER-stress en accumulatie van ongevouwen/verkeerd gevouwen eiwitten, dissocieert HSPA5 en leidt dit tot activering van deze effectoren, die vervolgens een reeks stroomafwaartse doelen activeren die helpen bij het oplossen van de ER-stress en, in extreme omstandigheden, celdood bevorderen6. Bij dissociatie van HSPA5 autofosforylaten PERK en wordt de kinase-activiteit geactiveerd7. De kinase-activiteit fosforyleert eIF2α, wat leidt tot translationele verzwakking, waardoor de eiwitbelasting van de ER8 wordt verlaagd. In aanwezigheid van fosfo-eukaryote initiatiefactor 2α (eIF2α) worden niet-vertaalde open leesframes op specifieke mRNA’s echter bij voorkeur vertaald, zoals ATF4, waardoor stress-geïnduceerde genen worden gereguleerd. ATF4 en C/EBP homoloog eiwit (CHOP) zijn transcriptiefactoren die door stress geïnduceerde genen reguleren en apoptose en celdoodroutes reguleren 9,10. Een van de doelen van ATF4 en CHOP is het groeistilstand en DNA-schade-induceerbare eiwit (GADD34), dat samen met eiwitfosfatase 1 peIF2α defosforylaat en fungeert als een feedbackregulator voor translationele demping11. Onder ER-stress dissocieert ATF6 van HSPA5 en wordt het Golgi-lokalisatiesignaal blootgesteld, wat leidt tot zijn translocatie naar het Golgi-apparaat. In het Golgi-apparaat wordt ATF6 gesplitst door plaats-1 protease (S1P) en plaats-2 protease (S2P) om de gesplitste vorm van ATF6 (ATF6 P50) vrij te maken. ATF6 p50 wordt vervolgens verplaatst naar de kern, waar het de expressie induceert van genen die betrokken zijn bij eiwitvouwing, rijping en secretie, evenals eiwitafbraak12,13. Tijdens ER-stress dissocieert IRE1 van HSPA5, multimeriseert en autofosforyleert14. Fosforylering van IRE1 activeert zijn RNase-domein, met name door de splitsing van 26 nucleotiden uit het centrale deel van het mRNA van X-box bindend eiwit 1 (XBP1)15,16. Dit genereert een nieuwe C-terminus die een transactiveringsfunctie verleent, waarbij functioneel XBP1s-eiwit wordt gegenereerd, een krachtige transcriptiefactor die verschillende door ER-stress geïnduceerde genen controleert17,18. De gecombineerde activiteit van deze transcriptiefactoren schakelt genetische programma’s in die gericht zijn op het herstellen van de ER-homeostase.
Er zijn verschillende methoden om ER-stress en UPR te detecteren. Deze omvatten de conventionele methoden voor het analyseren van de UPR-markers19,20. Verschillende niet-conventionele methoden omvatten het meten van de redoxtoestand van de UPR en de calciumverdeling in het ER-lumen, evenals het beoordelen van de ER-structuur. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om te zien hoeveel het ER-lumen toeneemt als reactie op ER-stress in cellen en weefsels. Deze methode is echter tijdrovend en afhankelijk van de beschikbaarheid van een elektronenmicroscoop, die mogelijk niet voor elke onderzoeksgroep beschikbaar is. Ook het meten van de calciumflux en de redoxtoestand van de ER is een uitdaging vanwege de beschikbaarheid van reagentia. Bovendien is de uitlezing van deze experimenten zeer gevoelig en kan deze worden beïnvloed door andere factoren van het cellulaire metabolisme.
Een krachtige en eenvoudige techniek voor het monitoren van de UPR-uitgangen is het meten van de activering van de verschillende signaalroutes van de UPR en wordt al tientallen jaren gebruikt in verschillende stressscenario’s. Deze conventionele methoden om UPR-activering te meten zijn economisch, haalbaar en leveren de informatie in minder tijd in vergelijking met andere bekende methoden. Deze omvatten immunoblotting om de expressie van UPR-markers op eiwitniveau te meten, zoals fosforylering van IRE1, PERK en eIF2α en splitsing van ATF6 door het meten van de P50-vorm van ATF6 en eiwitexpressie van andere markers zoals HSPA5, gesplitste XBP1, ATF4, CHOP en GADD34, evenals RT-PCR om de mRNA-niveaus te bepalen, evenals splitsing van XBP1-mRNA.
Dit artikel beschrijft een gevalideerde en betrouwbare reeks protocollen om ER-stress en UPR-activering in HIV-1-geïnfecteerde cellen te monitoren en om de functionele relevantie van UPR bij HIV-1-replicatie en infectiviteit te bepalen. De protocollen maken gebruik van gemakkelijk verkrijgbare en zuinige reagentia en geven overtuigende informatie over de UPR-uitgangen. ER-stress is het resultaat van de ophoping van ongevouwen/verkeerd gevouwen eiwitten, die vatbaar zijn voor de vorming van eiwitaggregaten21. Hierbij beschrijven we een methode om deze eiwitaggregaten te detecteren in HIV-1-geïnfecteerde cellen. Thioflavine T-kleuring is een relatief nieuwe methode die wordt gebruikt om deze eiwitaggregaten te detecteren en te kwantificeren22. Beriault en Werstuck beschreven deze techniek om eiwitaggregaten te detecteren en te kwantificeren en dus ER-stressniveaus in levende cellen. Het is aangetoond dat het kleine fluorescerende molecuul thioflavine T (ThT) selectief bindt aan eiwitaggregaten, met name amyloïde fibrillen.
In dit artikel beschrijven we het gebruik van ThT om ER-stress in HIV-1-geïnfecteerde cellen te detecteren en te kwantificeren en te correleren met de conventionele methode voor het monitoren van UPR door de activering van verschillende signaalroutes van UPR te meten.
Omdat er ook een gebrek is aan uitgebreide informatie over de rol van UPR tijdens HIV-1-infectie, bieden we een reeks protocollen om de rol van UPR bij HIV-1-replicatie en virioninfectiviteit te begrijpen. Deze protocollen omvatten de door lentivirus gemedieerde knockdown van UPR-markers en behandeling met farmacologische ER-stressinductoren. Dit artikel toont ook de soorten uitlezingen die kunnen worden gebruikt om de HIV-1-genexpressie, virale productie en de besmettelijkheid van de geproduceerde virionen te meten, zoals respectievelijk luciferase-test op basis van lange terminale herhaling (LTR), p24-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) en β-gal reporter-kleuringstest.
Met behulp van de meeste van deze protocollen hebben we onlangs de functionele implicatie van HIV-1-infectie op UPR in T-cellen23 gerapporteerd, en de resultaten van dat artikel suggereren de betrouwbaarheid van de hier beschreven methoden. Daarom biedt dit artikel een reeks methoden voor uitgebreide informatie over de wisselwerking tussen HIV-1 en ER-stress en UPR-activering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het toepassingsgebied van dit protocol omvat (i) de omgang met HIV-1-virusvoorraden en de meting van de virusconcentratie en virioninfectiviteit, (ii) infectie van T-cellen met HIV-1 en de beoordeling van het effect ervan op ER-stress en verschillende markers van UPR, (iii) Effect van knockdown van UPR-markers en hun effect op HIV-1 LTR-gestuurde genactiviteit, virusproductie en virion-infectiviteit en (iv) overstimulatie van de UPR met behulp van farmacologische moleculen en analyse va…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India, voor de intramurale ondersteuning. AT en AD zijn dankbaar voor de Ph.D. onderzoeksondersteuning ontvangen van het National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India. DM is dankbaar voor de JC Bose National Fellowship van SERB, de regering van India.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
Referenzen
- Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
- Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
- Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
- Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
- Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
- Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
- Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
- Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
- Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
- Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
- Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
- Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
- Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
- Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
- Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
- Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
- Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
- Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
- Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
- Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
- Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
- Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
- Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
- Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
- Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
- Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
- Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
- Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).
