HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi
Summary
Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR’nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Viral enfeksiyonlar, anormal protein birikimi nedeniyle Endoplazmik Retikulum (ER) stresine neden olarak Katlanmamış Protein Yanıtına (UPR) yol açabilir. Virüsler konak UPR’yi manipüle etmek için stratejiler geliştirmiştir, ancak literatürde UPR modülasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki fonksiyonel önemi hakkında ayrıntılı bir anlayış eksikliği vardır. Bu bağlamda, bu makalede, T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonu sırasında ER stres düzeylerini ve UPR’yi ölçmek için laboratuvarımızda kullanılan protokoller ve UPR’nin viral replikasyon ve enfektivite üzerindeki etkisi anlatılmaktadır.
Thioflavin T (ThT) boyama, protein agregatlarını tespit ederek hücrelerdeki ER stresini tespit etmek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir. Burada, ER stresini tespit etmek ve ölçmek için HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ThT boyama protokolünü gösterdik. Ayrıca, ER stresi, konvansiyonel immünoblotlama ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak, HIV-1 ile enfekte hücrelerde BiP, fosforile IRE1, PERK ve eIF2α gibi UPR belirteçlerinin seviyeleri, XBP1’in eklenmesi, ATF6, ATF4, CHOP ve GADD34’ün bölünmesi ile dolaylı olarak da tespit edildi. ThT-floresansının UPR aktivasyonunun göstergeleri ile ilişkili olduğunu bulduk. Bu makale ayrıca, ER stresi ve UPR modülasyonunun HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisini, nakavt deneyleri ve farmakolojik moleküllerin kullanımı ile analiz etmek için protokolleri göstermektedir. UPR’nin HIV-1 gen ekspresyonu/replikasyonu ve virüs üretimi üzerindeki etkisi sırasıyla Luciferaz raportör testleri ve p24 antijen yakalama ELISA ile analiz edilirken, virion enfektivitesi üzerindeki etkisi enfekte raportör hücrelerin boyanması ile analiz edildi. Toplu olarak, bu yöntem seti, HIV-1 enfeksiyonu sırasında Katlanmamış Protein Yanıt yollarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve karmaşık dinamiklerini ortaya çıkarır.
Introduction
Edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS), CD4 + T lenfositlerinin sayısında kademeli bir azalma ile karakterizedir, bu da immün yanıtın ilerleyici başarısızlığına yol açar. İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1), AIDS’in etken maddesidir. Zarflı, pozitif anlamlı, virion başına iki RNA kopyası olan tek sarmallı bir RNA virüsüdür ve retroviridae ailesine aittir. Konak hücre içinde yüksek konsantrasyonlarda viral proteinlerin üretilmesi, hücrenin protein katlama mekanizmasına aşırı stres uygular1. ER, ökaryotik hücrelerin salgı yolundaki ilk bölmedir. Proteinlerin üretilmesinden, değiştirilmesinden ve salgı yoluna ve hücre dışı boşluk hedef bölgelerine iletilmesinden sorumludur. Proteinler çok sayıda translasyon sonrası değişikliğe uğrar ve asparagine bağlı glikosilasyon ve moleküller arası ve moleküller arası disülfür bağlarınınoluşturulması dahil olmak üzere ER’de doğal konformasyonlarına katlanırlar 2. Bu nedenle, ER lümeninde yüksek konsantrasyonlarda protein bulunur ve bunlar agregasyona ve yanlış katlanmaya çok eğilimlidir. Gelişmiş protein sentezi veya protein mutasyonu gerektiren ısı şoku, mikrobiyal veya viral enfeksiyonlar gibi çeşitli fizyolojik durumlar, ER’de artan protein birikimi nedeniyle ER stresine yol açar ve böylece ER lümen homeostazını bozar. ER stresi, yüksek oranda korunmuş adaptif sinyal iletim yollarından oluşan bir ağı, Katlanmamış Protein Tepkisi (UPR)3 aktive eder. UPR, katlanmamış protein yükünü ve katlanma kapasitesini hizalayarak normal ER fizyolojik durumunu geri getirmek için kullanılır. Bu, ER boyutunun ve ER’de yerleşik moleküler şaperonların ve foldazların arttırılmasıyla sağlanır ve bu da ER’nin katlanma kabiliyetinin artmasına neden olur. UPR ayrıca, translasyonel seviyede küresel protein sentezi zayıflaması yoluyla ER’nin protein yükünü azaltır ve ER ile ilişkili bozunmayı (ERAD) yukarı regüle ederek katlanmamış proteinlerin ER’den temizlenmesini artırır4,5.
ER stresi, ER’de yerleşik üç transmembran protein tarafından algılanır: Protein kinaz R (PKR) benzeri endoplazmik retikulum kinaz (PERK), Aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) ve İnositol gerektiren enzim tip 1 (IRE1). Tüm bu efektörler, bağlayıcı protein (BiP)/78-kDa glikoz regüle protein (GRP78) olarak da bilinen şaperon Isı şoku protein ailesi A (Hsp70) üyesi 5’e (HSPA5) bağlanarak inaktif tutulur. ER stresi ve katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi üzerine, HSPA5 ayrışır ve bu efektörlerin aktivasyonuna yol açar, bu daha sonra ER stresinin çözülmesine yardımcı olan ve aşırı koşullarda hücre ölümünü teşvik eden bir dizi aşağı akış hedefini aktive eder6. HSPA5’ten ayrışma üzerine, PERK otofosforilatlar ve kinaz aktivitesi aktive edilir7. Kinaz aktivitesi eIF2α’yı fosforile eder, bu da translasyonel zayıflamaya yol açarak ER8’in protein yükünü düşürür. Bununla birlikte, fosfo-ökaryotik başlatma faktörü 2α (eIF2α) varlığında, spesifik mRNA’lar üzerindeki çevrilmemiş açık okuma çerçeveleri, strese bağlı genleri düzenleyen ATF4 gibi tercihli olarak çevrilir. ATF4 ve C/EBP homolog proteini (CHOP), strese bağlı genleri düzenleyen ve apoptoz ve hücre ölüm yolaklarını düzenleyen transkripsiyon faktörleridir 9,10. ATF4 ve CHOP’un hedeflerinden biri, protein fosfataz 1 defosforilat peIF2α ile birlikte ve translasyonel zayıflama11 için bir geri besleme düzenleyicisi olarak işlev gören büyüme durdurma ve DNA hasarına neden olan proteindir (GADD34). ER stresi altında, ATF6, HSPA5’ten ayrışır ve Golgi lokalizasyon sinyali açığa çıkar, bu da Golgi aygıtına translokasyonuna yol açar. Golgi aygıtında ATF6, ATF6’nın (ATF6 P50) parçalanmış formunu serbest bırakmak için bölge-1 proteaz (S1P) ve site-2 proteaz (S2P) tarafından parçalanır. ATF6 p50 daha sonra çekirdeğe translokasyon yapar, burada protein katlanması, olgunlaşması ve salgılanmasının yanı sıra protein bozunması12,13 ile ilgili genlerin ekspresyonunu indükler. ER stresi sırasında, IRE1 HSPA5’ten ayrışır, multimerleşir ve14’ü oto-fosforile eder. IRE1’in fosforilasyonu, RNaz alanını aktive eder, spesifik olarak X-box bağlayıcı protein 1’in (XBP1) mRNA’sının merkezi kısmından 26 nükleotidin eklenmesine aracılık eder15,16. Bu, transaktivasyon fonksiyonu sağlayan yeni bir C-terminali oluşturur ve birkaç ER stresinin neden olduğu geni kontrol eden güçlü bir transkripsiyon faktörü olan fonksiyonel XBP1s proteini üretir17,18. Bu transkripsiyon faktörlerinin birleşik aktivitesi, ER homeostazını geri yüklemeyi amaçlayan genetik programları açar.
ER stresini ve UPR’yi tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar, UPR belirteçlerini19,20 analiz etmek için geleneksel yöntemleri içerir. Çeşitli konvansiyonel olmayan yöntemler, UPR’nin redoks durumunun ve ER lümenindeki kalsiyum dağılımının ölçülmesinin yanı sıra ER yapısının değerlendirilmesini içerir. Elektron mikroskobu, hücrelerde ve dokularda ER stresine yanıt olarak ER lümeninin ne kadar büyüdüğünü görmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve her araştırma grubu için mevcut olmayabilecek bir elektron mikroskobunun mevcudiyetine bağlıdır. Ayrıca, reaktiflerin mevcudiyeti nedeniyle kalsiyum akışının ve ER’nin redoks durumunun ölçülmesi zordur. Ayrıca, bu deneylerden elde edilen okuma çok hassastır ve hücresel metabolizmanın diğer faktörlerinden etkilenebilir.
UPR çıkışlarını izlemek için güçlü ve basit bir teknik, UPR’nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçmektir ve onlarca yıldır çeşitli stres senaryolarında kullanılmaktadır. UPR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan bu geleneksel yöntemler ekonomiktir, uygulanabilirdir ve bilinen diğer yöntemlere kıyasla bilgileri daha kısa sürede sağlar. Bunlar, IRE1, PERK ve eIF2α’nın fosforilasyonu gibi protein düzeyinde UPR belirteçlerinin ekspresyonunu ölçmek için immünoblotlamayı ve ATF6’nın bölünmesini ve HSPA5, eklenmiş XBP1, ATF4, CHOP ve GADD34 gibi diğer belirteçlerin protein ekspresyonunu ölçerek ve ayrıca mRNA seviyelerini ve XBP1 mRNA’nın eklenmesini belirlemek için RT-PCR’yi içerir.
Bu makale, HIV-1 ile enfekte hücrelerde ER stresini ve UPR aktivasyonunu izlemek ve UPR’nin HIV-1 replikasyonu ve enfektivitesinde fonksiyonel önemini belirlemek için doğrulanmış ve güvenilir bir protokol setini açıklamaktadır. Protokoller, kolayca bulunabilen ve ekonomik reaktifleri kullanır ve UPR çıktıları hakkında ikna edici bilgiler sağlar. ER stresi, protein agregatları oluşturmaya eğilimli olan katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesinin sonucudur21. Burada, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde bu protein agregatlarını tespit etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Thioflavin T boyama, bu protein agregatlarını tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir22. Beriault ve Werstuck, canlı hücrelerde protein agregatlarını ve dolayısıyla ER stres seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için bu tekniği tanımladılar. Küçük floresan molekülü tioflavin T’nin (ThT) seçici olarak protein agregatlarına, özellikle amiloid fibrillere bağlandığı gösterilmiştir.
Bu makalede, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ER stresini tespit etmek ve ölçmek için ThT’nin kullanımını açıklıyoruz ve bunu, UPR’nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçerek geleneksel UPR izleme yöntemiyle ilişkilendiriyoruz.
HIV-1 enfeksiyonu sırasında UPR’nin rolü ile ilgili kapsamlı bilgi eksikliği olduğundan, UPR’nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesindeki rolünü anlamak için bir dizi protokol sunuyoruz. Bu protokoller, UPR belirteçlerinin lentivirüs aracılı yıkımının yanı sıra farmakolojik ER stres indükleyicileri ile tedaviyi içerir. Bu makale aynı zamanda HIV-1 gen ekspresyonu, viral üretim ve üretilen viryonların enfektivitesini ölçmek için kullanılabilecek okuma türlerini de göstermektedir, örneğin uzun terminal tekrar (LTR) bazlı lusiferaz testi, p24 enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve β-gal raportör boyama testi.
Bu protokollerin çoğunu kullanarak, yakın zamanda T hücreleri23’te HIV-1 enfeksiyonunun UPR üzerindeki fonksiyonel etkisini bildirdik ve bu makalenin sonuçları burada açıklanan yöntemlerin güvenilirliğini göstermektedir. Bu nedenle, bu makale, HIV-1’in ER stresi ve UPR aktivasyonu ile etkileşimi hakkında kapsamlı bilgi için bir dizi yöntem sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün kapsamı şunları içerir: (i) HIV-1 virüs stoklarının işlenmesi ve virüs konsantrasyonunun ve virion enfektivitesinin ölçülmesi, (ii) T-hücrelerinin HIV-1 ile enfeksiyonu ve bunun ER stresi ve farklı UPR belirteçleri üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi, (iii) UPR belirteçlerinin yıkılmasının etkisi ve bunların HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi üzerindeki etkisi, virüs üretimi ve virion enfektivitesi ve (iv) Farmakolojik molekül kullanarak UPR…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hindistan Hükümeti Ulusal Hücre Bilimi Merkezi, Biyoteknoloji Bölümü’ne okul içi desteği için teşekkür ederiz. AT ve AD, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü, Ulusal Hücre Bilimi Merkezi’nden alınan doktora araştırma desteği için minnettardır. DM, Hindistan Hükümeti SERB’den JC Bose Ulusal Bursu için müteşekkirdir.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
Referenzen
- Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
- Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
- Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
- Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
- Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
- Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
- Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
- Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
- Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
- Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
- Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
- Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
- Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
- Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
- Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
- Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
- Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
- Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
- Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
- Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
- Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
- Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
- Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
- Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
- Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
- Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
- Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
- Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).
