该方法描述了将狂犬病抗原封装到具有结构和材料特性的可生物降解聚合物微粒中,这些微粒能够在预定延迟后实现脉动释放。对从颗粒核心回收的抗原进行酶联免疫吸附测定 (ELISA) 评估,通过颗粒制造证实存在完整的三聚体狂犬病病毒糖蛋白。
目前的狂犬病暴露后预防指南要求在数周内进行多次注射。这对生活在低收入和中等收入国家(LMICs)的人来说可能是不成比例的负担,大多数致命的狂犬病暴露都发生在这些国家。已经探索了不同的药物递送策略,通过将抗原封装到聚合物颗粒中,将疫苗方案浓缩为单次注射。然而,包封过程中的苛刻应力源会导致包封抗原变性。本文介绍了一种将狂犬病病毒 (RABV) 抗原包封到聚合物微粒中的方法,这些微粒表现出可调脉动释放。这种方法被称为均匀液化和密封以封装药物的颗粒(PULSED),使用软光刻技术产生微粒,以从多光子,3D打印母模中产生反向聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具。然后将聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)薄膜压缩成型到PDMS模具中,以产生使用压电点胶机器人填充浓缩RABV的开口圆筒。然后通过加热颗粒顶部来密封这些微观结构,使材料流动并形成连续的无孔聚合物屏障。制造后,使用特异性于检测完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)来确认免疫原性抗原从微粒中的高回收率。
疫苗接种是一种极其有效的医疗保健工具,在2000年至2019年期间防止了3700多万人死亡1。尽管有这种有效性,但疫苗可预防的疾病继续对全球健康构成重大风险,特别是在低收入和中等收入国家,这些国家的未接种疫苗和疫苗接种不足率高,每年导致150万人死于疫苗可预防的死亡2。狂犬病也不例外。尽管狂犬病是人类已知的最致命的疾病,几乎普遍致命,但它是完全可以治疗的,并在许多高收入国家被归类为根除狂犬病。相反,生活在亚洲和非洲部分地区的人们不成比例地承担狂犬病的负担,该疾病对人类和牲畜造成毁灭性后果3,4。
疫苗接种对于管理狂犬病的全球影响至关重要5.考虑到该疾病的总体发病率较低,疫苗接种的成本禁止广泛实施暴露前预防(PrEP)。此外,在中低收入国家,暴露后预防(PEP)的效用受到寻求医疗保健的患者的社会经济压力的限制。后勤因素,例如到医疗保健接入点的旅行距离、获得治疗时的工资损失、治疗费用、干扰日常活动的预约和健忘,导致 PEP 依从率低至 60%6,7。这种高患者流失率为改进方法以解决狂犬病疫苗接种方面的差距以对抗该疾病提供了机会。
已经探索了控制抗原释放的单次注射(SI)疫苗接种系统,作为一次注射获得完全免疫的方法。消除多次访问医疗保健提供者的需要减轻了阻止个人寻求适当护理的负担。为了实现SI疫苗接种,抗原通常被封装在可生物降解的聚合物基质中,该基质通常采用可注射微粒的形式。一旦注射,聚合物降解并释放螯合的抗原。迄今为止,已经采取了两种主要释放策略来实现SI疫苗接种。在一种方法中,抗原在较长时间内连续释放。虽然旨在增强单次注射的免疫原性,但尚不清楚这种方法是否足以引起人类对狂犬病病毒(RABV)的保护性免疫反应8。另一种情况下,抗原在预定延迟后释放,以模仿常规且经过验证的初免加强疫苗方案。喷雾干燥和基于乳液/溶剂蒸发的微粒制造方法展示了前一种策略,并已成功包封模型疫苗9和高稳定性抗原,例如破伤风类毒素10。然而,这些封装方法涉及压力源,包括热、溶剂相互作用和物理力,这些压力会使抗原变性11。
均匀液化和密封以封装药物的颗粒(PULSED)是最近开发的一种制造方法,可用于将生物制剂封装在可生物降解的微粒中。微成型用于产生充满液体有效载荷并加热的颗粒,以使聚合物回流并完全封装在可生物降解聚合物的连续层内。这种微观结构导致有效载荷的脉冲释放,其持续时间取决于聚合物壳12的降解速率。本手稿演示了灭活的 RABV 封装在由聚(乳酸-共乙醇酸)(PLGA)(一种用于许多 FDA 批准的配方中的可生物降解聚合物13)组成的微粒中,使用 PULSED 制造方法来封装通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 评估的稳定 RABV 抗原。通过将具有不同分子量和/或端基的PLGA颗粒相结合,这种方法有可能模仿单次注射后的当前狂犬病疫苗接种时间过程。
可以根据特定需求改变粒子几何形状;然而,对于圆柱形结构,作者建议保持协议中描述的高度:直径:壁厚的5:4:1比例。这种纵横比可确保存在足够的PLGA材料来密封颗粒,并保持足够的机械坚固性以进行处理。在CAD过程中可以轻松更改颗粒尺寸和形状,从而生成无数的几何形状。将CAD的灵活性与3D打印相结合,可以快速迭代微粒设计。尽管该协议使用多光子3D打印机,但任何具有能够以适当材料打印微观结构尺寸的规格的3D打印机都可用于生成初始母模。此外,光刻以前已被用于在阵列中制造类似的结构,其结构比本协议中产生的结构大得多;然而,劳动力、订购定制光掩模的延迟以及设备的可访问性将减慢迭代设计过程16.最后,如果内部母模制造不可行,母模生产可以外包给有偿服务公司。无论使用3D打印机或用于生成母模的方法如何,打印件与基材的附着力对于下游步骤都至关重要。具体来说,如果在PDMS模具生成过程中附着力不足,打印颗粒将保留在PDMS模具中,需要手动去除打印颗粒并破坏母模。
颗粒填充是另一个需要考虑的关键方面。微粒的填充能力有限,因此过滤不仅用于浓缩RABV抗原,还用于去除原本会占据微粒核心体积很大一部分的原液赋形剂。然而,鉴于RABV抗原的大尺寸(约60 nm×180 nm)17,在离心步骤中可以部分沉淀出抗原。因此,重要的是在离心后通过移液或涡旋重悬抗原,以实现RABV抗原的高回收率。高浓度溶液是分液的理想选择,因为它减少了分液周期,从而限制了分样过程中的抗原降解。然而,粘度是压电点胶机器人形成稳定液滴的主要限制,因此可能不可能或不可取地分配非常高浓度的溶液。稀释填充溶液是实现稳定液滴形成的最简单方法,但应考虑实现所需负载所需的额外填充周期内的抗原稳定性以及填充颗粒所需的较长时间。
局限性
这种方法需要高度专业化的设备来生产初始模具和用于微粒生产的专用填充仪器。尽管通过按服务收费的方法可以颠覆对具有能够生成初始母模的打印分辨率的3D打印机的需求,但压电点胶机器人的可访问性是有限的。采购压电点胶机器人需要大量的初始前期投资,通常在 80,000 美元到 200,000 美元之间,具体取决于品牌、吞吐量和功能。尽管其他几种填充方法是潜在的替代方案,但这些方法尚未使用RABV抗原12进行验证。
未来应用
相当大比例的包封RABV抗原在密封过程中保持稳定。理论上,通过将这种抗原掺入由不同类型的PLGA组成的颗粒中,模仿暴露后预防治疗的给药时间表,所有剂量都可以在一次注射中给药。消除重复就诊以管理额外剂量的需要将提高患者的依从性,从而获得更好的治疗结果。此外,在证明能够保留高度复杂的灭活狂犬病病毒的ELISA反应性之后,其他抗原(包括亚单位疫苗)很可能与这种包封方法兼容。使用带有脉冲微粒的其他预防性抗原可以通过提高疫苗接种不足人群的疫苗接种率来挽救低收入和中等收入国家的数百万人的生命。然而,为了实现这一目标,疫苗不仅必须通过封装保持稳定,还必须通过释放保持稳定,这可能具有挑战性,因为有效载荷将受到体温和由于体热和PLGA降解产物而可能出现的酸性微环境的影响18。未来的工作将通过释放来稳定抗原的策略,这将为广泛适用于预防许多传染病的单次注射疫苗接种平台开辟潜力。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Chiron Behring和Bharat Biotech International为人类提供RABV抗原颗粒。我们还要感谢Charles Rupprecht,VMD,MS,PhD.的宝贵指导和技术贡献。作者要感谢Rebecca Richards-Kortum博士的慷慨,允许使用她的SciFLEXARRAYER S3皮升分配设备,以及Chelsey Smith博士关于使用该设备的指导。我们还感谢马萨诸塞大学陈医学院生成狂犬病抗原的显微镜图像。最后,我们感谢Don Chickering和Erin Eulano在提交之前审查了该文件。这项工作得到了比尔和梅林达·盖茨基金会的资助(INV-004360)。
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |