Fabricage van pulsatiele polymere microdeeltjes die rabiësantigeen inkapselen

1. Deeltjesmaster schimmel generatie OPMERKING: Het 3D-printproces kan worden uitgevoerd met elke 3D-printer met voldoende ruimtelijke resolutie; het huidige protocol beschrijft echter het proces voor een multi-foton 3D-printer. Ontwerp microdeeltjesstructuren met behulp van een CAD-programma (Computer-aided Design).OPMERKING: De ontwerpspecificaties zijn als volgt: 308 deeltjes (diameter = 400 μm, hoogte = 500 μm en wanddikte = 100 μm) zijn gerangschikt in een array van 22 bij 14, met een afstand van 600 μm ertussen. Het ontwerp bevat ook een vierpuntige ster en een vijfpuntige ster als fiducicalen direct buiten de array (aanvullende figuur 1). Exporteer het definitieve ontwerp als een STL-bestand (Supplementary Coding File 1) en upload het bestand naar software die de afdrukparameters kan definiëren zoals hieronder weergegeven. Sla het vervolgens op als een bestand dat compatibel is met de 3D-printer (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Snijafstand = 5 μm, broedafstand = 1 μm, schaalcontour = 50 μm, basisschijftelling = 5 μm, steiger = hol, scanmodus = galvo, z-as = microscoop z-drive, scansnelheid = 100.000, vermogen = 100. Voorbehandel een siliciumdruksubstraat (zie materiaaltabel) met behulp van een plasmareinigingsproces (gas: Ø2; vermogen: 200 watt; temperatuur: 25 °C; debiet: 20; tijd: 5 min), dompel het substraat vervolgens onmiddellijk onder in een oplossing van 30 ml ethanol en 60 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylaat in een glazen petrischaal. Dek af met aluminiumfolie en laat ‘s nachts incuberen.OPMERKING: Deze stap verhoogt de hechting van de afdruk op het substraat, wat belangrijk is tijdens PDMS-scheiding (stap 2.6). Upload het afdrukbestand naar de multi-foton 3D-printer, breng de printhars aan op het behandelde substraat, laad de 10x lens (zie Materiaaltabel) en print de microstructuren. Als u klaar bent, dompelt u de afdruk gedurende 45 minuten onder in propyleenglycolmethyletheracetaat (zie materiaaltabel) om onbelichte fotoresist te verwijderen en dompelt u de afdruk vervolgens gedurende 5 minuten onder in isopropylalcohol. Laat de mastermal na uitharden door deze gedurende 120 minuten bloot te stellen aan UV-licht bij 254 nm.OPMERKING: Indien beschikbaar, kan UV-licht in het bereik van 405 tot 365 nm gedurende ~ 20 minuten worden gebruikt om de geprinte structuren na uitharding te gebruiken. 2. Polydimethylsiloxaan (PDMS) schimmel generatie Behandel het oppervlak van de 3D-geprinte mastermal door deze in een vacuümkamer te plaatsen met een glazen dia met 40 μL trichloor (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctyl) (zie materiaaltabel) silaan toegevoegd aan het oppervlak. Trek aan het vacuüm (relatieve druk: -20 in. Hg) gedurende 1 uur.OPMERKING: Deze stap zorgt voor een eenvoudige scheiding bij het ontvormen (stap 2.6). Terwijl het hoofdmatrijsoppervlak wordt behandeld, mengt u de polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeerbasis grondig met het PDMS-prepolymeeruithardingsmiddel in een massaverhouding van 9: 1 (ten minste 10 g materiaal is nodig voor elke mastermal). Eenmaal grondig gemengd, breng het niet-uitgeharde PDMS over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g . Zodra de oppervlaktebehandeling is voltooid, plaatst u de hoofdmal in een aluminiumfolieschaal en giet u het niet-uitgeharde PDMS bovenop de mal, zodat de functies volledig onder water staan. Plaats de aluminiumfolieschaal in een vacuümkamer en trek aan het vacuüm (relatieve druk: -20 in. Hg) gedurende 1 uur om luchtbellen te verwijderen. Verwijder de aluminiumfolieschaal uit de vacuümkamer. Plaats afstandhouders van 800 μm aan de uiteinden van de mastermal en leg een schone glazen schuif op de mastermal, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Gebruik binderclips om de mal en de schuif aan elkaar te klemmen, waarbij de klemkracht over de afstandhouders wordt gelokaliseerd (aanvullende figuur 2). Plaats de structuur gedurende ten minste 4 uur in een oven die op 120 °C is ingesteld om het prepolymeer in PDMS-mallen uit te harden. Verwijder de structuur uit de oven, laat de bindmiddelclips voorzichtig los en scheid de hoofdvorm voorzichtig van de uitgeharde PDMS-mal met behulp van een scheermesje.OPMERKING: De 3D-geprinte mastermal kan worden hergebruikt om extra PDMS-mallen te genereren. 3. PLGA film fabricage Weeg 450 mg PLGA af (zie materiaaltabel) en plaats deze op een anti-aanbakpolymeerplaat van 76 mm bij 76 mm in een 250 μm dikke ringshim, met een binnendiameter van 50,8 mm. Plaats een tweede anti-aanbakpolymeerplaat over de PLGA en druk de stapel tussen twee aluminium blokken met behulp van een 101,6 mm c-klem tot een vingerdicht.OPMERKING: 502H PLGA werd uitsluitend in deze studie gebruikt; andere soorten PLGA zijn echter compatibel met dit proces. Plaats het c-geklemde samenstel in een vacuümoven op 120 °C gedurende 30 minuten onder vacuüm, met een relatieve druk van -30 in.Hg. Verwijder vervolgens de montage en draai de klem stevig vast voordat u deze nog eens 30 minuten in de vacuümoven plaatst.OPMERKING: Het primaire doel van het gebruik van een vacuüm is om PLGA-degradatie te voorkomen, die bij hoge temperaturen wordt versneld. Haal het geheel uit de oven en laat het 4 uur afkoelen in een exsiccator. Eenmaal afgekoeld, maakt u de klem los, verwijdert u de PLGA-film van de anti-aanbakpolymeervellen en plaatst u de film in een gelabelde petrischaal. Bewaar de petrischaal in een exsiccator voor later gebruik. 4. PLGA deeltjes generatie Behandel het oppervlak van de PDMS-mal zoals eerder beschreven in stap 2.1. Knip met een pincet en/of een scalpel een deel van de 250 μm PLGA-film, ongeveer zo groot als de array, uit en plaats deze op de behandelde PDMS-mal. Leg een schone glazen microscoopschuif bovenop de PLGA-film en PDMS-mal en klem de componenten aan elkaar door een veerklem direct over de array en PLGA-film te plaatsen. Plaats de geklemde matrijsassemblage in de vacuümoven die is ingesteld op 120 °C en trek het vacuüm met een relatieve druk van -30 in. Hg gedurende 1 uur.OPMERKING: De tijd die nodig is om de deeltjes te vormen is afhankelijk van de PLGA en kan variëren van 1-12 uur. Haal de geklemde vormset uit de oven en laat deze ongeveer 15 minuten passief afkoelen bij kamertemperatuur, of tot het afkoelt. Oefen met een scheermesje voorzichtig druk uit tussen de PDMS-mal en de PLGA-deeltjesarray om de twee te scheiden. Bewaar de PLGA-deeltjes in een exsiccator voor toekomstig gebruik. 5. Antigeenconcentratie en -zuivering Ontdooi één aliquot van in de handel verkrijgbaar RABV-antigeen (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur. Monteer de filtratie-opstelling door twee centrifugale spinfilters met een 100 kDa molecuulgewichtsafsnijding (MWCO; zie materiaaltabel) in twee opvangbuizen te plaatsen. Maak de twee centrifugale centrifugaalspinfilters voor door 500 μL UltraPure-water toe te voegen. Draai de filters op 2.400 x g gedurende 1 minuut in een benchtopcentrifuge bij kamertemperatuur. Verwijder het water uit zowel het bovenste als het onderste compartiment van de filtratie-opstelling met behulp van een pipet van 200 μL.OPMERKING: Laat het voorbevochtigde centrifugeerfilter niet uitdrogen. Voeg 400 μL gedestilleerd water toe aan het bovenste compartiment van elk centrifugeerfilter, voeg vervolgens 100 μL van het ontdooide RABV-antigeen toe en meng met de pipet.OPMERKING: Deze studie concentreerde het antigeen ongeveer vijfvoudig en verminderde de concentratie van hulpstoffen < 100 kDa met ~ 50-voudig. Laad de twee centrifugaalspinfilters in een tafelcentrifuge en zorg ervoor dat de filters naar het midden van de centrifuge zijn gericht. Markeer welke kant van het filter naar het midden van de centrifuge is gericht.OPMERKING: Als de oplossingen verkeerd zijn georiënteerd, worden ze niet goed gefilterd/geconcentreerd. Centrifugeer de filters op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Haal de filters uit de centrifuge. De opvangbuizen bevatten het filtraat, terwijl de filters het geconcentreerde monster bevatten (aanvullende figuur 3A). Verwijder het filtraat in de opvangbuizen met een pipet en gooi het weg. Voeg 450 μL gefilterd gedestilleerd water toe aan elk filter en meng het geconcentreerde monster en water door zes keer op en neer te pipetteren. Centrifugeer de twee centrifugeerfilters een tweede keer op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de filters in dezelfde richting naar het midden van de centrifuge zijn gericht als in stap 5.7. Haal de filtereenheden uit de centrifuge en verwijder en gooi het filtraat net als voorheen met een pipet uit elke buis. Verwijder de spinfilters uit de opvangbuizen en sluit de filterbehuizingen af met de bovenkant van de opvangbuizen (aanvullende figuur 3B). Plaats de bodem van de centrifugeerbehuizingen direct op een vortex en vortex bij 3.000 tpm gedurende 30 s terwijl u de filterbehuizingen rechtop en onder een hoek van 45° houdt (aanvullende figuur 3C).OPMERKING: Deze stap is bedoeld om RABV-antigeen dat tijdens het centrifugeerproces een pellet heeft gevormd, te resuspenderen. Verwijder voorzichtig de dop van de opvangbuizen uit de centrifugeerfilterbehuizingen. Plaats de filterbehuizingen terug in de meegeleverde opvangbuizen en voer een snelle draai (2-3 s) uit om het volume te verzamelen dat mogelijk in de dop is vastgelopen.OPMERKING: Deze snelle spin moet worden uitgevoerd in een benchtop microcentrifuge. De filters moeten raken aan de centrifuge, in tegenstelling tot de vorige configuratie, om ervoor te zorgen dat er geen oplossing verloren gaat door de filters. Keer elke spinfiltereenheid om in een nieuwe opvangbuis die bij de spinfilterkit wordt geleverd (zie materiaaltabel) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur om de geconcentreerde monsters te verzamelen. Consolideer de geconcentreerde monsters uit de twee opvangbuizen in één opvangbuis. Meet en registreer het resulterende volume.OPMERKING: Het resulterende monster heeft 5x de initiële antigeenconcentratie als de stam, heeft een kleine concentratie van het hulpstof (<100 kDa) die ongeveer 50 keer lager is dan de stam en ziet er enigszins melkachtig wit uit. Het totale volume moet ongeveer 44-48 μL zijn. Bewaar het 5x geconcentreerde, tweemaal gewassen antigeen bij 4 °C tot het moment van doseren, maar niet langer dan 16 uur. Voordat u deeltjes met deze oplossing vult, centrifugeert u de buis gedurende 1 minuut op 1.000 x g om eventuele bellen te verwijderen. De oplossing mag met gedestilleerd water worden verdund om de nominale streefconcentratie voor afgifte te bereiken. 6. Deeltjesvulling Vacuümfilter 500 ml gedeïoniseerd water door een vacuümfilter van 0,22 μm en ontgast vervolgens de oplossing door een vacuüm toe te passen (relatieve druk: -20 in. Hg) tijdens ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten. Bevestig gedurende deze tijd de piëzo-doseercapillairen (PDC’s; zie materiaaltabel) aan de piëzo-elektrische dispenser. Bereid de machine voor volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en plaats de dia met de PLGA-deeltjes in het doseergebied. Stel de “Find Target Reference Points” in, Run en stel vervolgens het “Target Substrate” in, volgens aanvullende figuur 4. Laad 25 μL van het geconcentreerde antigeen in de bronplaat en laad het in de machine. Zuig met behulp van de PDC’s 10 μL geconcentreerd antigeen in de doseerpunt, was de buitenkant van de punt en kalibreer vervolgens de uitlijning van de dosering (aanvullende figuur 5). Voer “Target Setup parameters” in en klik op de Run (Aanvullende figuur 6). Zodra u klaar bent, verwijdert u de gevulde deeltjes en controleert u of ze onder een stereoscoop zijn gevuld. Ga direct naar de volgende stap in het protocol. 7. Deeltjesafdichting en oogst Plaats een roestvrijstalen blok (zie materiaaltabel) op een kookplaat. Plaats twee microscoopglaasjes op het roestvrijstalen blok zodat ze evenwijdig zijn. Zorg ervoor dat het roestvrijstalen blok waterpas staat, zet vervolgens de kookplaat aan en stel de temperatuur zo in dat de oppervlaktetemperatuur van het roestvrij staal 200 °C is. Controleer de temperatuur van de kookplaat voordat u deze afdicht. Hang de gevulde PLGA-deeltjes boven de kookplaat door ze op de twee glazen dia’s te plaatsen en start vervolgens onmiddellijk een timer voor 18 s.OPMERKING: De hoeveelheid tijd en warmtedeeltjes die moeten worden afgedicht, is afhankelijk van de chemische eigenschappen van de PLGA die wordt gebruikt om de deeltjes te maken. Een aangepaste 3D-geprinte diahouder kan worden gebruikt om de dia’s op een veilige afstand van de kookplaat te verwerken. Het STL-bestand wordt geleverd als Supplementary Coding File 2. Eenmaal verzegeld, verwijdert u de deeltjesarray van de kookplaat en hangt u deze boven de laboratoriumbank door de deeltjesarray op twee afzonderlijke glazen dia’s te plaatsen. Laat de deeltjes 1 minuut afkoelen. Eenmaal afgekoeld, kunnen de deeltjes worden geoogst met behulp van een scalpel terwijl ze door een stereoscoop kijken. Houd het scalpel met het mes in een hoek van 45° ten opzichte van de dia en oefen druk uit op de basis van het deeltje om het van de glasplaat te scheiden. Eenmaal geoogst, gebruik het scalpel om de deeltjes over te brengen in 0,5 ml eiwitarme bindbuizen (zie tabel met materialen). Vul vervolgens de buizen met 250 μL van een 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) met 30 mg / ml runderserumalbumine (BSA) en 1 mg / ml glucose.OPMERKING: De 30 mg/ml BSA en 1 mg/ml glucose-oplossing bereid in PBS zal de stabiliteit van het RABV-antigeen behouden. Plet de deeltjes onder een stereoscoop met een pincet met een fijne punt. Zorg ervoor dat het RABV-antigeen in de kern van het deeltje beschikbaar is om te worden opgelost in de omringende oplossing. Bewaar de monsters in een koelkast van 4 °C totdat de antigeenpotentie kan worden geëvalueerd met behulp van een ELISA. Monsters moeten binnen 7 dagen na bereiding op een ELSIA worden uitgevoerd. 8. Evaluatie van het antigeen door ELISA LET OP: Laat de microplaatjes op geen enkel moment uitdrogen. Stapel platen altijd en bedek de bovenste plaat altijd met een plastic afdichting, een lege plaat of een deksel om uitdroging te voorkomen. Bereid de buffers voor volgens de instructies in Aanvullend Dossier 1. Bereid 5 ml coatingoplossing (carbonaat-bicarbonaatbuffer, pH 9,6) in een concentratie van 2,5 μg/ml door 25 μl van het coatingantilichaam toe te voegen aan 4975 μl coatingbuffer bij pH 9,4-9,6.OPMERKING: 5 ml is nodig om 96 putten te coaten met elk 50 μL (met extra volume voor pipetteerverlies). Verhoog het totale volume met 5 ml voor elke extra ELISA-plaat die nodig is. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 μL van de coatingoplossing in elk putje van de microplaat te doseren. De oplossing moet onmiddellijk na de bereiding voor coating worden gebruikt. Tik zachtjes langs de plaatranden op een gehandschoende handpalm om ervoor te zorgen dat de bodem van elke put gelijkmatig bedekt is met vloeistof. Sluit de plaat af met kleeffolie en plaats deze gedurende 1 uur op 37 °C en breng deze vervolgens een nacht over naar 4 °C. Haal de platen uit de koelcel en was ze drie keer met 200 μL wasbuffer in elk putje. Verwijder de wasbuffer en doseer 300 μL blokkeringsbuffer in elk putje.LET OP: Wanneer u meerdere platen uitvoert met dezelfde monsters die op verschillende platen worden herhaald, is het belangrijk om plaat voor plaat verder te gaan (d.w.z. plaat 1 vullen met het materiaal voordat u doorgaat naar plaat 2 en vervolgens naar plaat 3 enzovoort). Breng materiaal X niet aan op alle platen en vervolgens op materiaal Y, enz., Omdat dit het risico op uitdroging van putten zou vergroten. Na de laatste wasstap moet de wasbuffer in de putjes van de plaat blijven en alleen onmiddellijk worden weggegooid voordat monsters aan de plaat worden toegevoegd. Een plastic 96-well plaatdeksel moet worden gebruikt om alle putten van de ELISA-plaat te bedekken die niet meteen worden gedoseerd, en het deksel wordt sequentieel verplaatst om extra putten te onthullen die met materiaal moeten worden gevuld. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie (zie materiaaltabel) en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C. Bereid de standaardcurve en testmonsters voor die tijdens deze incubatie moeten worden geëvalueerd.OPMERKING: Het antigeen dat wordt geëvalueerd, moet vooraf worden verdund in verdunningsbuffer met een aanbevolen verdunning van 0,125 IE/ml, met een overmaat aan volume van ten minste 40 μl om pipetteerverlies te voorkomen. Alle monsters worden in tweevoud (twee technische replicaties) op elke ELISA-plaat beoordeeld. Voor de standaardcurve moet in de kolommen 2 en 3 van elke Elisa-plaat een tweevoudige verdunningsreeks voor in totaal acht punten worden opgenomen. Voor alle andere monsters kan een verdunningsreeks worden uitgevoerd met een passend aantal punten op basis van de voorspelde hoeveelheid antigeen die wordt geëvalueerd. Hoewel minder rigoureus voor een hogere doorvoer, kan een enkele monsterverdunning worden gebruikt als alternatief voor de hierboven beschreven beplating. De verwachte concentratie van een enkele verdunning moet echter binnen het standaardcurvebereik vallen. Voer in eiwitarme 96-putplaten of eiwitbuizen met een lage binding (zie materiaaltabel) een tweevoudige verdunningsreeks van elk monster uit langs de kolommen van de plaat. Belast het begin van de verdunningsreeks in rij A voor elk respectievelijk monster met het dubbele van het vereiste eindvolume (per plaat is 100 μL monster per put vereist, dus alle putjes in A2-A11 moeten ten minste 240 μL van een monster bevatten, met een extra volume van 40 μL om pipetteerverlies te compenseren). Laad 120 μL verdunningsbuffer in alle andere putjes op de eiwitplaat met een lage binding, met uitzondering van de kolommen 1 en 12 (d.w.z. B2 tot en met H11). Gebruik een meerkanaalspipet geladen met 10 tips, voer seriële verdunning uit door 120 μL monster over te brengen van A2-A11 naar B2-B11 en meerdere keren op en neer te pipetteren om te mengen terwijl spatten en bellen worden vermeden. Herhaal dit proces en beweeg langs de plaat langs de kolommen naar de putjes H2-H11. Gooi het resterende volume van 120 μL dat uit de laatste rij putjes is geaspireerd, weg.OPMERKING: De monsters zijn nu klaar voor analyse. Als de blokkeringsfase tegen die tijd nog niet is voltooid, zorg er dan voor dat de monsters op ijs worden bewaard. Was aan het einde van de incubatiestap de platen drie keer met 200 μL wasbuffer. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL verdunningsbuffer over in de kolommen 1 en 12 als de “blanco’s”. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL over van elke put van de eiwitarme 96-putplaat met monsterverdunningen naar de gewassen ELISA-plaat. Herhaal dit voor alle ELISA-platen die worden uitgevoerd. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C. Bereid de oplossing voor het detectieantilichaam (zie de tabel met materialen) in een concentratie van 0,2 μg/ml door 4,4 μl van de antilichaamoplossing toe te voegen aan 10,995,6 μl van de verdunningsbuffer en meng goed door op en neer te pipetteren.OPMERKING: Een totaal van 11 ml is nodig voor 96 putten van elk 100 μL (met extra volume voor pipetteerverliezen). Verhoog het totale volume met 11 ml voor elke extra ELISA-plaat die wordt geëvalueerd. De oplossing moet onmiddellijk na de bereiding worden gebruikt. Was aan het einde van de incubatiestap de platen vijf keer met 200 μL wasbuffer. Zuig de resterende wasbuffer op en doseer 100 μL van de detectieantilichaamoplossing in elk putje op de microplaat met behulp van een meerkanaalspipet. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C. Bereid het conjugaat voor tegen het einde van de incubatiestap van het detectieantilichaam door 4,4 μl streptavidine-peroxidaseconjugaatoplossing (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 10.995,6 μl wasbuffer.OPMERKING: Een totaal van 11 ml is nodig voor 96 putten van elk 100 μL (met extra volume voor meerkanaals pipetteren). Verhoog het totale volume met 11 ml voor elke extra ELISA-plaat die wordt geëvalueerd. Was de borden vijf keer met 200 μL wasbuffer. Zuig de resterende wasbuffer aan en doseer 100 μL van de geconjugeerde oplossing aan elk putje. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze in een incubator van 37 °C gedurende 60 ± 5 minuten bij 37 ± 2 °C. Bereid het substraat voor tijdens de laatste wasstap volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Los voor elke plaat één tablet o-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD; zie tabel met materialen) op in 9 ml gedeïoniseerd water in het donker en vul vervolgens aan met 1 ml 10x stabiele peroxidebuffer. Pas het aantal tabletten en het totale volume van de oplossing (10 ml) aan op basis van het aantal platen dat wordt geëvalueerd. Was de borden vijf keer met 200 μL wasbuffer. Doseer 100 μL van het substraat aan elke put met behulp van een meerkanaalspipet. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic film en laat ze 10-20 minuten op de bank liggen, beschermd tegen licht, met aluminiumfolie.OPMERKING: Controleer de kleurontwikkeling visueel om verzadiging te voorkomen. Voeg onmiddellijk 50 μL stopoplossing toe aan elke put en de afleesplaat voor absorptie bij 492 nm en een referentieabsorptie van 620 nm. Analyseer de gegevens met behulp van de gecorrigeerde absorptiewaarde (aflezing bij 492 nm minus de aflezing bij 620 nm) en trek het gemiddelde van de blanco van alle monsters af. Gebruik een sigmoïdale 4PL-interpolatiemethode om absorptiewaarden om te zetten in IE/ml. Vermenigvuldig ten slotte met de 250 μL (totaal monstervolume) om om te zetten in IE.OPMERKING: Deze analyse kan worden uitgevoerd met behulp van data-analysesoftware.