Ablação laser direcionada no embrião de Saccharina latissima
Summary
A destruição de células específicas no embrião é uma ferramenta poderosa para estudar as interações celulares envolvidas no destino celular. O presente protocolo descreve técnicas para a ablação a laser de células-alvo no embrião inicial da alga marrom Saccharina latissima.
Abstract
Em Saccharina latissima, o embrião desenvolve-se como uma folha celular monocamada chamada lamina ou a lâmina. Cada célula embrionária é fácil de observar, prontamente distinguível de seus vizinhos, e pode ser alvo individual. Por décadas, a ablação a laser tem sido usada para estudar o desenvolvimento de embriões. Aqui, um protocolo para ablação a laser específica para células foi desenvolvido para embriões iniciais da alga marrom S. latissima. O trabalho apresentado inclui: (1) a preparação de embriões de Sacarina , com descrição dos parâmetros críticos, incluindo condições culturais, (2) as configurações de ablação a laser e (3) o monitoramento do crescimento subsequente do embrião irradiado utilizando microscopia de lapso de tempo. Além disso, são fornecidos detalhes sobre as condições ideais para o transporte dos embriões da plataforma de imagem de volta ao laboratório, o que pode afetar profundamente o desenvolvimento subsequente de embriões. Algas pertencentes à ordem Laminariales exibem padrões de embriogênese semelhantes à Sacarina; este protocolo pode, assim, ser facilmente transferido para outras espécies neste taxon.
Introduction
A ablação a laser tem sido usada há décadas para estudar o desenvolvimento de embriões. Irradiar células embrionárias com um raio laser torna possível monitorar o potencial regenerativo e a modificação da linhagem celular durante a embriogênese e investigar o impacto da ablação direcionada na divisão celular e no destino celular. Os organismos modelo utilizados em métodos de ablação a laser são tipicamente animais, como insetos 1,2, nematoides 3,4, vertebrados 5,6 e, ocasionalmente, plantas 7,8. Além disso, uma abordagem de micro-ablação a laser foi usada na alga marrom Fucus em 1994 e 1998 para demonstrar o papel da parede celular na fotopolarização do embrião inicial 9,10.
Algas marrons pertencem ao grupo Stramenopiles, divergiram na raiz da árvore eucariótica há 1,6 bilhões de anos. Como resultado, são filogeneticamente independentes de outros organismos multicelulares, como animais e plantas11. Saccharina latissima pertence à ordem Laminariales, mais comumente conhecida como algas, e estão entre os maiores organismos da Terra, atingindo tamanhos de mais de 30 m. Saccharina sp. é uma grande alga marinha usada para muitas aplicações, como alimentos e ração, e seus polissacarídeos são extraídos para uso nas indústrias agrícola, farmacológica e cosmética em todo o mundo12, 13 anos. Seu cultivo, principalmente na Ásia e mais recentemente na Europa, requer a preparação de embriões em incubatórios antes de liberar jovens em mar aberto. Como todas as algas, ela tem um ciclo de vida bifásico composto por uma fase gametofitica microscópica, durante a qual um gametofito de haploide cresce e produz gametas para fertilização, e uma fase esporofítica macroscópica diploide, onde uma grande lâmina planar se desenvolve a partir de seu protetor de retenção ligado ao fundo do mar ou rochas. O sporófito libera esporos haploides na maturidade, completando assim o ciclo de vida 14,15,16.
S. latissima apresenta algumas características morfológicas interessantes17. Seu embrião desenvolve-se como uma folha de planar monocamadas 15,18,19 antes de adquirir uma estrutura multicamadas coincidindo com o surgimento de diferentes tipos de tecidos. Além disso, laminariales é um dos únicos taxas de algas marrons cujos embriões permanecem ligados ao seu tecido gametofistico materno (Desmarestiales e Sporochnales também15). Essa característica oferece a oportunidade de estudar o papel do tecido materno nesse processo de desenvolvimento e comparar mecanismos de controle materno em algas marrons com os de animais e plantas.
Este artigo apresenta o primeiro protocolo completo para ablação a laser em um embrião de algas primitiva. Este protocolo envolvendo a técnica UV ns-pulsed resulta na destruição específica de células embrionárias individuais para estudar seus respectivos papéis durante a embriogênese. O procedimento oferece uma abordagem confiável para investigar interações celulares e destino celular durante a embriogênese em Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ablação a laser celular local permite a ablação temporal e espacial com um alto nível de precisão. No entanto, sua eficiência pode ser dificultada pela não acessibilidade das células-alvo; por exemplo, todas as células são de um embrião tridimensional. Este protocolo foi desenvolvido no embrião da alga Saccharina latissima, que desenvolve uma lâmina monocamada na qual todas as células podem ser facilmente distinguidas e destruídas individualmente com um raio laser.
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Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A bolsa de doutorado da S.B. é financiada pela Region Bretagne (Número de Subvenção ARED COH20020) e pela Sorbonne Université. I.T.is bolsa de doutorado é financiada pela Região Bretagne (Número de Subvenção ARED COH18020) e pela Universidade Norvegiana NMBU. Este projeto recebeu apoio financeiro do CNRS por meio dos programas interdisciplinares do MITI. MRic é membro da infraestrutura nacional France-BioImaging apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
Referenzen
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
