Gezielte Laserablation im Embryo von Saccharina latissima
Summary
Die Zerstörung bestimmter Zellen im Embryo ist ein mächtiges Werkzeug, um zelluläre Interaktionen zu untersuchen, die am Zellschicksal beteiligt sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt Techniken zur Laserablation von Zielzellen im frühen Embryo der Braunalge Saccharina latissima.
Abstract
Bei Saccharina latissima entwickelt sich der Embryo als einschichtiges Zellblatt, das als Lamina oder Klinge bezeichnet wird. Jede Embryozelle ist leicht zu beobachten, leicht von ihren Nachbarn zu unterscheiden und kann individuell anvisiert werden. Seit Jahrzehnten wird die Laserablation zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Hier wurde ein Protokoll zur zellspezifischen Laserablation für frühe Embryonen der Braunalge S. latissima entwickelt. Die vorgestellte Arbeit umfasst: (1) die Vorbereitung von Saccharina-Embryonen mit einer Beschreibung der kritischen Parameter, einschließlich der Kulturbedingungen, (2) die Laserablationseinstellungen und (3) die Überwachung des nachfolgenden Wachstums des bestrahlten Embryos mittels Zeitraffermikroskopie. Darüber hinaus werden Details zu den optimalen Bedingungen für den Transport der Embryonen von der Bildgebungsplattform zurück ins Labor gegeben, was die spätere Embryonalentwicklung tiefgreifend beeinflussen kann. Algen aus der Ordnung der Laminariales weisen ähnlich wie Saccharina ähnliche Embryogenesemuster auf; dieses Protokoll lässt sich somit leicht auf andere Arten in diesem Taxon übertragen.
Introduction
Die Laserablation wird seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Die Bestrahlung von Embryozellen mit einem Laserstrahl ermöglicht es, das Regenerationspotenzial und die Veränderung der Zelllinie während der Embryogenese zu überwachen und den Einfluss einer gezielten Ablation auf die Zellteilung und das Zellschicksal zu untersuchen. Die Modellorganismen, die in Laserablationsmethoden verwendet werden, sind typischerweise Tiere, wie Insekten 1,2, Nematoden 3,4, Wirbeltiere 5,6 und gelegentlich Pflanzen 7,8. Darüber hinaus wurde 1994 und 1998 ein Laser-Mikroablationsansatz an der Braunalge Fucus verwendet, um die Rolle der Zellwand bei der Photopolarisation des frühen Embryos 9,10 zu demonstrieren.
Braunalgen gehören zur Gruppe der Stramenopiles, die sich vor 1,6 Milliarden Jahren an der Wurzel des eukaryotischen Baumes abspalteten. Dadurch sind sie phylogenetisch unabhängig von anderen vielzelligen Organismen wie Tieren und Pflanzen11. Saccharina latissima gehört zur Ordnung der Laminariales, besser bekannt als Seetang, und sie gehören zu den größten Organismen der Erde und erreichen Größen von über 30 m. Saccharina sp. ist eine große Alge, die für viele Anwendungen wie Lebens- und Futtermittel verwendet wird, und ihre Polysaccharide werden für den Einsatz in der landwirtschaftlichen, pharmakologischen und kosmetischen Industrie weltweit extrahiert12, 13. Seine Kultivierung, hauptsächlich in Asien und in jüngster Zeit in Europa, erfordert die Vorbereitung von Embryonen in Brütereien, bevor Jungtiere im offenen Meer freigelassen werden. Wie alle Seetange hat es einen biphasischen Lebenszyklus, der aus einer mikroskopisch kleinen gametophytischen Phase besteht, in der ein haploider Gametophyt wächst und Gameten zur Befruchtung produziert, und einer diploiden makroskopischen sporophytischen Phase, in der sich eine große planare Klinge entwickelt, die von ihrem Festhalten am Meeresboden oder an Felsen befestigt ist. Der Sporophyt setzt bei der Reife haploide Sporen frei und schließt damit den Lebenszyklus14,15,16 ab.
S. latissima weist einige interessante morphologische Merkmaleauf 17. Sein Embryo entwickelt sich als einschichtiges planares Blatt15,18,19, bevor es eine mehrschichtige Struktur annimmt, die mit der Entstehung verschiedener Gewebetypen zusammenfällt. Darüber hinaus ist Laminariales eines der wenigen Taxa von Braunalgen, deren Embryonen an ihrem mütterlichen Gametophytengewebe haften bleiben (Desmarestiales und Sporochnales tun dies auch15). Dieses Feature bietet die Möglichkeit, die Rolle des mütterlichen Gewebes in diesem Entwicklungsprozess zu untersuchen und die mütterlichen Kontrollmechanismen in Braunalgen mit denen in Tieren und Pflanzen zu vergleichen.
Dieser Artikel stellt das erste vollständige Protokoll für die Laserablation in einem frühen Seetangembryo vor. Dieses Protokoll mit UV-ns-gepulster Technik führt zur spezifischen Zerstörung einzelner Embryozellen, um ihre jeweilige Rolle während der Embryogenese zu untersuchen. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung von Zellinteraktionen und Zellschicksal während der Embryogenese in Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und räumliche Ablation mit hoher Präzision. Seine Effizienz kann jedoch durch die Nichtzugänglichkeit von Zielzellen beeinträchtigt werden; Zum Beispiel sind alle Zellen von einem dreidimensionalen Embryo. Dieses Protokoll wurde am Embryo der Alge Saccharina latissima entwickelt, die eine einschichtige Lamina entwickelt, in der alle Zellen leicht identifiziert und einzeln mit einem Laserstrahl zerstört werden können.
<p class="jove_content"…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das PhD-Stipendium von S.B. wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH20020) und der Sorbonne Université finanziert. I.T.is PhD-Stipendium wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH18020) und der Norvegian NMBU University finanziert. Dieses Projekt wurde vom CNRS durch die interdisziplinären MITI-Programme finanziell unterstützt. MRic ist Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-10-INBS-04) unterstützt wird.
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
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