Summary

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

Published: November 30, 2021
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

Abstract

הסיליום העיקרי הוא אברון איתות קריטי שנמצא כמעט בכל תא שמתמר את הקיפוד (Hh) ומאותת לגירויים מפני השטח של התא. במבשר תאי הגרגיר (GCP), הסיליום הראשי משמש כמרכז איתות מרכזי המתזמר את התפשטות התאים המבשרים על ידי ויסות מסלול האיתות של Hh. החקירה של מכונות איתות Hh תלויות cilium העיקרית מתאפשרת על ידי מניפולציה גנטית במבחנה של רכיבי המסלול כדי לדמיין את הלוקליזציה הדינמית שלהם לסיליום הראשי. עם זאת, טרנספקטציה של טרנסג’נים בתרבויות העיקריות של GCPs באמצעות שיטות אלקטרופורציה הידועות כיום היא בדרך כלל יקרה ולעתים קרובות גורמת בכדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטורה לא רצויה. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה יעיל, חסכוני ופשוט המדגים יעילות טרנספקטירה גבוהה של ~ 80-90% ואת הכדאיות התא האופטימלית. זוהי שיטת שינוי גנטי פשוטה, ניתנת לשחזור ויעילה החלה על חקר מסלול האיתות העיקרי התלוי בסיליום בתרבויות GCP ראשוניות.

Introduction

GCPs המוח הקטן נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את המכונות של מסלול איתות Hh בסוגי תאים אב עצביים בשל השפע הגבוה שלהם רגישות גבוהה למסלול איתות Hh ב vivo1,2,3,4. ב- GCPs, הסיליום העיקרי פועל כרכזת העברת אות Hh מרכזית 5 המתזמרת את התפשטות התאים המבשרים6,7,8. הדמיה חוץ גופית של רכיבי איתות Hh על הסיליום הראשי הוא לעתים קרובות מאתגר בשל רמות הבסיס האנדוגניות הנמוכות שלהם. לפיכך, שינוי טרנסג’ן של רמות ביטוי חלבון ותיוג פלואורופור של גן העניין הן גישות שימושיות כדי ללמוד את המסלול ברזולוציה מולקולרית. עם זאת, מניפולציה גנטית של תרבויות ראשיות GCP באמצעות גישות transfection מבוססות ליפוזום לעתים קרובות לגרום יעילות טרנספקטיבה נמוכה, מעכב חקירות מולקולריות נוספות9. אלקטרופורציה מגבירה את היעילות אך בדרך כלל דורשת ריאגנטים אלקטרופורציה ספציפיים לספקים מופקעים וסוג התאים 10.

מאמר זה מציג שיטת אלקטרופורציה יעילה וחסכונית לתפעול רכיבי מסלול האיתות של Hh בתרבויות הראשיות של GCP. באמצעות פרוטוקול אלקטרופורציה שונה זה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מתויג טרנסג’ן החלקה (pEGFP-Smo) נמסר ביעילות GCPs והשיג שיעורי הישרדות וטרנספקטיה גבוהים של תאים (80-90%). יתר על כן, כפי שמעיד הכתם החיסוני, GCPs שהושפעו הטרנסג’נדרים הראו רגישות גבוהה להפעלה אגוניסטית החלקה של מסלול האיתות HH על ידי סחר EGFP-Smo לסיסים העיקריים. פרוטוקול זה יהיה ישים ישירות ומועיל לניסויים הכרוכים בשינוי גנטי במבחנה של סוגי תאים שקשה להעביר, כגון תרביות תאים ראשוניים אנושיים ומכרסמים, כמו גם תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ולפרוטוקול שאושר על ידי משרד הבריאות, הונג קונג. רישיונות לניסויים בבעלי חיים בעקבות פקודת בעלי חיים (פיקוח על ניסויים) (סעיף 340) התקבלו ממשרד הבריאות, ממשלת הונג קונג. העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם לאתיקה לבטיחות בעלי חי?…

Representative Results

באמצעות Opti-MEM (ראה טבלת החומרים) כמגיב האוניברסלי, מתודולוגיית אלקטרופורציה מוצעת זו יכולה להשיג יעילות אלקטרופורציה גבוהה באופן עקבי בשיעור של ~80-90% (איור 1). יעילות האלקטרופורציה של וקטור Smo-EGFP נקבעה ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה על ידי כימות אחוז התאים החיוביים לפלואור…

Discussion

טרנספקטציה של טרנסג’נים בתרבות GCP ראשונית על ידי שיטת אלקטרופורציה קשורה בדרך כלל עם כדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטיבה ירודה9,10. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה חסכוני וניתן לשחזור שהפגין יעילות גבוהה וכדאיות. בנוסף, אנו גם מדגימים שיטה פשוטה של לימו?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן הזרעים HKBU ומענק הסטארט-אפ Tier-2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), קרן מחקר מועצת המחקר השיתופית של המועצה למענק מחקר (CRF-C2103-20GF) ל- C.H.H. Hor.

Materials

GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

Referenzen

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Entwicklungsbiologie. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Entwicklungsbiologie. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

View Video