과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법
Summary
여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.
Abstract
1차 실륨은 고슴도치(Hh)가 세포 표면으로부터 자극을 신호하는 거의 모든 세포에서 발견되는 중요한 신호 세포입니다. 과립 세포 전구체(GCP)에서, 1차 실슘은 Hh 신호 경로를 조절하여 전구체 세포 증식을 오케스트레이션하는 중추적인 신호 센터역할을 한다. 1차 실슘 의존Hh 시그널링 기계류의 조사는 경로 구성 요소의 체외 유전자 조작에 의해 촉진되어 동적 국소화를 1차 실륨으로 시각화합니다. 그러나, 현재 알려진 전기기화 방법을 사용하는 GCP의 1차 배양에서 의 전염은 일반적으로 비용이 많이 들며 종종 낮은 세포 생존력과 바람직하지 않은 트랜스포션 효율을 초래한다. 이 백서는 ~80-90%의 높은 배분 효율과 최적의 세포 생존가능성을 보여주는 효율적이고 비용 효율적이며 간단한 전기 기립 프로토콜을 소개합니다. 이것은 1 차적인 GCP 문화에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 연구 결과에 적용되는 간단하고 재현 가능하고 능률적인 유전 수정 방법입니다.
Introduction
소뇌GCP는 생체 내에서 Hh 신호 경로에 대한 높은 풍부함과 높은 민감성으로 인해 뉴런 전구 세포 유형의 Hh 신호 경로의 기계를 연구하는 데 널리 사용됩니다. GCP에서, 1차 실슘은 전구체 세포의 증식을 조율하는 중추적인 Hh 신호 변환 허브5로서 작용한다6,7,8. 1차 실륨에서 Hh 신호 성분의 체외 시각화는 낮은 내인성 기저 수준으로 인해 종종 도전적입니다. 따라서, 관심 유전자의 단백질 발현 수준 및 형광소 태깅의 유전자 변형은 분자 해상도에서 경로를 연구하는 유용한 접근이다. 그러나, 지방성 기지를 둔 transfection 접근을 사용하여 GCP 1 차적인 배양을 유전 조작은 수시로 더 분자 조사를 방해하는 낮은 transfection 효율성 귀착됩니다9. 전기기화는 효율성을 증가하지만 일반적으로 엄청난 공급 업체 별 및 세포 유형 제한 전기 기리 작용10이 필요합니다.
이 논문은 GCP 1차 배양에서 Hh 신호 경로 구성 요소를 조작하는 고효율 및 비용 효율적인 전기 포기법을 소개합니다. 이러한 변형된 전기기화 프로토콜을 사용하여, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그된 스무텐 트랜스진(pEGFP-Smo)은 GCP에 효율적으로 전달되었고 높은 세포 생존율(80-90%)을 달성하였다. 더욱이, 면역세포화학 염색에 의해 입증된 바와 같이, 감염된 GCP는 EGFP-Smo를 1차 섬모로 인신매매함으로써 Hh 신호 경로의 편평한 작용제 유도 활성화에 높은 민감성을 보였다. 이 프로토콜은 인간 및 설치류 1차 세포 배양뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포와 같이 트랜스펙트하기 어려운 세포 유형의 체외 유전자 변형을 포함하는 실험에 직접적으로 적용되고 유익합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전기기화 방법에 의한 1차 GCP 배양에서 의 전형적 트랜스펙트(transfection)는 전형적으로 낮은 세포 생존력 및 불량한 형질 효율9,10과 연관된다. 이 백서는 고효율과 생존력을 입증한 비용 효율적이고 재현 가능한 전기 화 프로토콜을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 cilium 의존적인 Hh 신호 통로를 공부하는 간단한 방법을 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 HKBU 시드 펀드와 Tier-2 스타트업 그랜트 (RG-SGT2/18-19/SCI/SCI/009), 연구 보조금 위원회-협력 연구 기금 (CRF-C2103-20GF)에서 C.H.H. Hor에 의해 지원되었습니다.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
Referenzen
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