Summary

高效且具有成本效益的电穿孔方法研究颗粒细胞前体中的原代纤毛依赖性信号通路

Published: November 30, 2021
doi:

Summary

在这里,我们提出了一种可重复的 体外 电穿孔方案,用于原代小脑颗粒细胞前体(GCP)的遗传操作,具有成本效益,高效且可行。此外,该协议还展示了一种简单的方法,用于原代GCP细胞中原代纤毛依赖性刺猬信号通路的分子研究。

Abstract

原代纤毛是一种关键的信号细胞器,几乎存在于从细胞表面转导刺猬(Hh)信号刺激的每个细胞上。在颗粒细胞前体(GCP)中,原代纤毛充当关键信号中心,通过调节Hh信号通路来协调前体细胞增殖。通过对通路成分的 体外 遗传操作来促进原发性纤毛依赖性Hh信号传导机制的研究,以可视化它们对原发性纤毛的动态定位。然而,使用目前已知的电穿孔方法在GCP的初级培养物中转染转基因通常成本高昂,并且通常导致细胞活力低和不良转染效率。本文介绍了一种高效、经济且简单的电穿孔方案,该方案显示出~80-90%的高转染效率和最佳的细胞活力。这是一种简单、可重复且高效的遗传修饰方法,适用于研究原代 GCP 培养物中原发性纤毛依赖性刺猬信号通路。

Introduction

小脑GCP由于其在体内对Hh信号通路的高丰度和高敏感性,被广泛用于研究神经元祖细胞类型Hh信号通路的机制1234。在GCP中,原发纤毛充当关键的Hh信号转导中枢5,协调前体细胞的增殖678。原发性纤毛上Hh信号传导成分的体外可视化通常具有挑战性,因为它们的内源性基础水平较低。因此,蛋白质表达水平的转基因修饰和目标基因的荧光团标记是在分子分辨率下研究该途径的有用方法。然而,使用基于脂质体的转染方法对 GCP 原代培养物进行遗传操作通常会导致转染效率低下,从而阻碍进一步的分子研究9。电穿孔可提高效率,但通常需要过多的供应商专用和电池类型受限的电穿孔试剂10

本文介绍了一种高效且具有成本效益的电穿孔方法,用于操纵基仕伯原代培养物中的Hh信号通路组分。使用这种改良的电穿孔方案,绿色荧光蛋白(GFP)标记的平滑转基因(pEGFP-Smo)有效地递送到GCP,并实现了高细胞存活率和转染率(80-90%)。此外,如免疫细胞化学染色所证明的那样,转染的GCP对平滑激动剂诱导的Hh信号通路激活表现出高度敏感性,方法是将EGFP-Smo转运到原代纤毛。该协议应直接适用于涉及难以转染的细胞类型的 体外 遗传修饰的实验,例如人类和啮齿动物原代细胞培养物,以及人类诱导多能干细胞。

Protocol

所有与动物有关的程序均按照动物处理指引及香港卫生署批准的规程进行。根据《动物(实验控制)条例》(第340章)取得动物实验牌照,已向香港政府卫生署索取。动物工作是按照香港浸会大学研究处及实验室安全委员会批准的动物安全道德规范进行的。有关此协议中使用的所有材料的详细信息,请参阅材料 表 。 1. 体验前准备 培养基和缓…

Representative Results

使用Opti-MEM(见 材料表)作为通用试剂,这种提出的电穿孔方法可以实现〜80-90%的持续高电穿孔效率(图1)。在电穿孔后DIV 2处,通过定量所有配对的盒状蛋白-6(Pax6)表达GCP细胞中绿色荧光阳性细胞的百分比来确定Smo-EGFP载体的电穿孔效率。DMSO和SAG处理基团的电穿孔效率似乎相当(图1 和 表2)。 此外,…

Discussion

通过电穿孔法转染原代GCP培养物中的转染基因通常与细胞活力低和转染效率差有关910。本文介绍了一种具有成本效益且可重复的电穿孔方案,该协议已被证明具有高效率和可行性。此外,我们还展示了一种研究原代GCP细胞中原代纤毛依赖性Hh信号通路的简单方法。

其他常见的电穿孔方法通常需要昂贵的细胞类型特异性电穿孔试剂?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究获浸会大学种子基金及2级启动资助(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究资助局合作研究基金(CRF-C2103-20GF)资助予C.H.H. Hor。

Materials

GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

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