Summary

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Published: November 30, 2021
doi:

Summary

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP’s) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Abstract

Het primaire cilium is een kritisch signaalorganel dat op bijna elke cel wordt aangetroffen en dat Egel (Hh) signaalprikkels van het celoppervlak transduceert. In de granulaatcelvoorloper (GCP) fungeert het primaire cilium als een cruciaal signaleringscentrum dat de proliferatie van voorlopercellen orkestreert door de Hh-signaalroute te moduleren. Het onderzoek van primaire cilium-afhankelijke Hh-signaleringsmachines wordt vergemakkelijkt door in vitro genetische manipulatie van de pathway-componenten om hun dynamische lokalisatie naar het primaire cilium te visualiseren. Transfectie van transgenen in de primaire culturen van GCP’s met behulp van de momenteel bekende elektroporatiemethoden is echter over het algemeen kostbaar en resulteert vaak in een lage levensvatbaarheid van cellen en ongewenste transfectie-efficiëntie. Dit artikel introduceert een efficiënt, kosteneffectief en eenvoudig elektroporatieprotocol dat een hoge transfectie-efficiëntie van ~ 80-90% en optimale levensvatbaarheid van de cel aantoont. Dit is een eenvoudige, reproduceerbare en efficiënte genetische modificatiemethode die van toepassing is op de studie van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute in primaire GCP-culturen.

Introduction

Cerebellaire GCP’s worden veel gebruikt om de machinerie van de Hh-signaleringsroute in neuronale voorloperceltypen te bestuderen vanwege hun hoge abundantie en hoge gevoeligheid voor de Hh-signaleringsroute in vivo1,2,3,4. In GCP’s fungeert het primaire cilium als een cruciale Hh-signaaltransductiehub5 die de proliferatie van de voorlopercellen orkestreert6,7,8. In vitro visualisatie van Hh-signaleringscomponenten op het primaire cilium is vaak een uitdaging vanwege hun lage endogene basale niveaus. Vandaar dat transgene modificatie van eiwitexpressieniveaus en fluorofoor tagging van het gen van belang nuttige benaderingen zijn om de route met moleculaire resolutie te bestuderen. Genetische manipulatie van primaire GCP-culturen met behulp van op liposomen gebaseerde transfectiebenaderingen resulteert echter vaak in een lage transfectie-efficiëntie, waardoor verder moleculair onderzoek wordt belemmerd9. Elektroporatie verhoogt de efficiëntie, maar vereist vaak exorbitante leverancierspecifieke en celtype-beperkte elektroporatiereagentia10.

Dit artikel introduceert een zeer efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om de Hh-signaalroutecomponenten in GCP-primaire culturen te manipuleren. Met behulp van dit gemodificeerde elektroporatieprotocol werd een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld smoothened transgen (pEGFP-Smo) efficiënt afgeleverd aan GCP’s en bereikte het hoge celoverlevings- en transfectiesnelheden (80-90%). Bovendien, zoals blijkt uit de immunocytochemische kleuring, vertoonden de getransfecteerde GCP’s een hoge gevoeligheid voor gladgestreken agonist-geïnduceerde activering van de Hh-signaleringsroute door EGFP-Smo naar de primaire trilharen te smokkelen. Dit protocol is rechtstreeks toepasselijk en gunstig voor experimenten waarbij in vitro genetische modificatie van moeilijk te transfecteren celtypen, zoals primaire celculturen bij mens en knaagdier, alsmede door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, betrokken zijn.

Protocol

Alle diergerelateerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het hanteren van dieren en het protocol dat is goedgekeurd door het ministerie van Volksgezondheid, Hong Kong. Vergunningen voor dierproeven volgens de Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) werden verkregen van het ministerie van Volksgezondheid, de regering van Hong Kong. Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethiek van de dierveiligheid die is goedgekeurd door het HKBU Research Office en het Lab…

Representative Results

Met behulp van de Opti-MEM (zie de tabel met materialen) als universeel reagens, zou deze voorgestelde elektroporatiemethodologie een consistent hoge elektroporatie-efficiëntie kunnen bereiken bij ~ 80-90% (figuur 1). De elektroporatie-efficiëntie van de Smo-EGFP-vector werd bepaald bij DIV 2 na elektroporatie door kwantificering van het percentage groene fluorescentiepositieve cellen in alle gepaarde boxeiwit-6 (Pax6)-tot expressie brengende GCP-cellen. De elektroporatie-…

Discussion

Transfectie van transgenen in primaire GCP-cultuur door elektroporatiemethode wordt meestal geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen en een slechte transfectie-efficiëntie9,10. Dit artikel introduceert een kosteneffectief en reproduceerbaar elektroporatieprotocol dat een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid heeft aangetoond. Daarnaast demonstreren we ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signalerings…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door HKBU Seed Fund en Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) aan C.H.H. Hor.

Materials

GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

Referenzen

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Entwicklungsbiologie. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Entwicklungsbiologie. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

View Video