Визуализация в реальном времени CCL5-индуцированной миграции периостальных скелетных стволовых клеток у мышей

Восстановление переломов – это динамичный, многоклеточный процесс, который отличается от эмбрионального развития и ремоделирования скелета. Во время этого процесса индукция сигналов повреждения из поврежденной ткани сопровождается быстрым набором, пролиферацией и последующей дифференцировкой скелетных стволовых / прогениторных клеток, которые имеют решающее значение для общей стабильности и фиксации ^{переломов1}. В частности, ранние стадии заживления переломов требуют мягкого образования мозоли, которое в основном относят к периостальным резидентным ^{клеткам2}. Когда кости повреждаются, подмножество периостальных клеток быстро реагирует и способствует недавно дифференцированным промежуточным продуктам хряща и остеобластам в ^{мозоли3}, что подразумевает наличие отдельной скелетной популяции стволовых / прогениторных клеток в надкостнице. Таким образом, идентификация и функциональная характеристика периостеальных скелетных стволовых клеток (SSC) представляют собой перспективный терапевтический подход к дегенеративным заболеваниям костей и дефектам ^кости4.

Считается, что SSC находятся в нескольких местах ткани, включая костный мозг. Подобно костному мозгу, остеогенные/хондрогенные SSC также были идентифицированы в надкостнице4,5,6.  Эти периостальные SSC (P-SSC) могут быть помечены маркерами ранней мезенхимальной линии (т.е. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 и Axin2-CreER8) во время развития костей плода4,7,8,9,10. Существенным ограничением этих моделей отслеживания одиночных генетических линий является то, что существует существенная гетерогенность в меченых клеточных популяциях. Кроме того, они не могут отличить меченые SSC от своего потомства in vivo. Чтобы устранить это ограничение, мы недавно разработали двойную репортерную мышь (Mx1-Cre ⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺) для четкой визуализации P-SSC из SSC костного мозга (BM-SSC)¹¹. С помощью этой модели было определено, что P-SSC отмечены двойной маркировкой Mx1 ⁺ αSMA ⁺, тогда как более дифференцированные клетки Mx1 ⁺ находятся в костном мозге, эндостеальных и периостальных поверхностях, а также кортикальных и трабекулярных костях11,12.

Известно, что множественные цитокины и факторы роста регулируют ремоделирование и восстановление костей и были протестированы на усиление восстановления скелета при критических дефектах ^{сегмента1,13}. Однако из-за клеточной сложности моделей травм, генерируемых разрушением физического барьера костного компартмента, прямое влияние этих молекул на эндогенную миграцию и активацию P-SSC во время заживления неясно. Функциональные характеристики и миграционная динамика SSC часто оцениваются in vitro путем выполнения трансвелл или скретч-анализа в сочетании с цитокинами или факторами роста, которые, как известно, индуцируют миграцию в других клеточных популяциях. Таким образом, интерпретация результатов этих экспериментов in vitro для применения в соответствующих системах in vivo является сложной задачей. В настоящее время in vivo оценка миграции скелетных стволовых/клеток-предшественников обычно не наблюдается в режиме реального времени; скорее, он измеряется в фиксированных временных точках после перелома5,7,14,15,16.

Ограничение этого метода заключается в том, что миграция не оценивается на уровне одной клетки; скорее, он измеряется через изменения в клеточных популяциях. Благодаря недавним достижениям в области прижизненной микроскопии живых животных и генерации дополнительных репортерных мышей, отслеживание in vivo отдельных клеток теперь возможно. Используя прижизненную микроскопию живых животных, мы наблюдали отчетливую миграцию P-SSC из ниши шва кальварии в травму кости в течение 24-48 ч после травмы у мышей Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 был недавно определен в качестве регулирующего механизма, влияющего на набор и активацию P-SSC во время раннего реагирования на травмы. Интересно, что не было обнаружено существенной миграции P-SSC в ответ на травму в режиме реального времени. Тем не менее, лечение травмы с помощью CCL5 приводит к надежной, направленной миграции P-SSC, которая может быть зафиксирована в режиме реального времени. Поэтому целью данного протокола является предоставление подробной методологии регистрации миграции P-SSC in vivo в режиме реального времени после лечения CCL5.