Real-time beeldvorming van CCL5-geïnduceerde migratie van periosteale skeletstamcellen bij muizen

Fractuurherstel is een dynamisch, meercellig proces dat verschilt van embryonale skeletontwikkeling en remodellering. Tijdens dit proces wordt de inductie van letselsignalen van beschadigd weefsel gevolgd door de snelle rekrutering, proliferatie en daaropvolgende differentiatie van skeletstam / voorlopercellen, die allemaal van cruciaal belang zijn voor de algehele stabiliteit en fixatie van ^fracturen1. In het bijzonder vereisen vroege stadia van fractuurgenezing zachte eeltvorming, die voornamelijk wordt toegeschreven aan periostale residente ^cellen2. Wanneer botten gewond zijn, reageert een subset van periostale cellen snel en draagt bij aan nieuw gedifferentieerde kraakbeentussenproducten en osteoblasten in het ^eelt3, wat de aanwezigheid van een afzonderlijke skeletstam / voorlopercelpopulatie in het botvlies impliceert. Daarom vormen de identificatie en functionele karakterisering van de periosteum-residente skeletstamcellen (SSC’s) een veelbelovende therapeutische aanpak voor degeneratieve botziekten en botdefecten4.

SSC’s worden verondersteld zich op meerdere weefsellocaties te bevinden, waaronder het beenmerg. Net als bij beenmerg zijn osteogene/chondrogene SSC’s ook geïdentificeerd in het botvlies4,5,6.  Deze periostale SSC’s (P-SSC’s) kunnen worden gelabeld met vroege mesenchymale afstammingsmarkers (d.w.z. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 en Axin2-CreER8) tijdens de foetale botontwikkeling4,7,8,9,10. Een belangrijke beperking van deze single genetic lineage tracing modellen is dat er een aanzienlijke heterogeniteit is binnen gelabelde celpopulaties. Bovendien kunnen ze gelabelde SSC’s niet onderscheiden van hun nageslacht in vivo. Om deze beperking aan te pakken, hebben we onlangs een dubbele reportermuis ontwikkeld (Mx1-Cre ⁺ Rosa26-Tomato ⁺ α SMA-GFP ⁺) om P-SSC’s duidelijk te visualiseren van beenmerg-SSC’s (BM-SSC’s)¹¹. Met dit model is vastgesteld dat P-SSC’s worden gekenmerkt door Mx1⁺αSMA⁺ dual labeling, terwijl meer gedifferentieerde Mx1⁺ cellen zich bevinden in het beenmerg, endosteale en periostale oppervlakken, en corticale en trabeculaire ^botten11,12.

Van meerdere cytokines en groeifactoren is bekend dat ze botremodellering en -reparatie reguleren en zijn getest op de verbetering van skeletherstel in kritieke segmentdefecten1,13. Vanwege de cellulaire complexiteit van letselmodellen die worden gegenereerd door verstoring van de fysieke barrière van het botcompartiment, zijn de directe effecten van deze moleculen op endogene P-SSC-migratie en activering tijdens genezing onduidelijk. De functionele kenmerken en migratiedynamiek van SSC’s worden vaak in vitro beoordeeld door een transwell- of scratch-assay uit te voeren, in combinatie met cytokines of groeifactoren waarvan bekend is dat ze migratie in andere celpopulaties induceren. De interpretatie van de resultaten van deze in vitro experimenten voor toepassing in hun overeenkomstige in vivo systemen is dus een uitdaging. Momenteel wordt in vivo beoordeling van de migratie van skeletstam/voorlopercellen doorgaans niet in realtime waargenomen; in plaats daarvan wordt het gemeten op vaste tijdspunten na de breuk5,7,14,15,16.

Een beperking van deze methode is dat migratie niet op eencellig niveau wordt beoordeeld; in plaats daarvan wordt het gemeten via veranderingen in celpopulaties. Vanwege recente vooruitgang in intravitale microscopie van levende dieren en het genereren van extra reportermuizen, is in vivo tracking van individuele cellen nu mogelijk. Met behulp van levende dier intravitale microscopie observeerden we de verschillende migratie van P-SSC’s van de calvaria hechting niche naar een botletsel binnen 24-48 uur na verwonding in Mx1 / Tomato / αSMA-GFP muizen.

CCL5/CCR5 werd onlangs geïdentificeerd als een regulerend mechanisme dat de rekrutering en activering van P-SSC’s beïnvloedt tijdens de vroege blessurerespons. Interessant is dat er geen detectie was van substantiële P-SSC-migratie als reactie op een verwonding in realtime. Behandeling van een verwonding met CCL5 produceert echter een robuuste, richtingsafhankelijke migratie van P-SSC’s, die in realtime kan worden vastgelegd. Daarom is het doel van dit protocol om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het registreren van de in vivo migratie van P-SSC’s in realtime na behandeling met CCL5.