쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰
Summary
이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.
Abstract
Periosteal 골격 줄기 세포 (P-SSC)는 평생 뼈 유지 보수 및 수리에 필수적이며 골절 치유를 향상시키기 위한 치료법 개발에 이상적인 초점입니다. Periosteal 세포는 골절 치유를 위한 새로운 연골 세포 및 골세포를 공급하기 위하여 상해로 급속하게 이동합니다. 전통적으로, 세포 이동을 유도 하는 사이토카인의 효능은 트랜스웰 또는 스크래치 분석 능력을 수행 하 여 체외에서 만 실시 되었습니다. 다광원 여기를 이용한 인트라바이탈 현미경법의 발전과 함께, 최근 1) P-SSC가 CCL5로 알려진 CCR5 리간드를 이용한 철새 유전자 CCR5 및 2) 치료를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, CCL5에 대응하여 골절 치유및 P-SSC의 이동을 향상시킨다. 이러한 결과는 실시간으로 캡처되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CCL5로 치료 후 부상으로 칼변이 봉합사 골격 줄기 세포(SSC) 틈새 에서 P-SSC 마이그레이션을 시각화하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 마우스 구속 및 이미징 마운트의 구성, 마우스 칼바리아의 수술 준비, 칼바리아 결함 유도 및 시간 경과 이미징의 수집에 대해 자세히 설명합니다.
Introduction
골절 수리는 배아 골격 발달 및 리모델링과 구별되는 동적 다세포 과정입니다. 이 과정에서 손상된 조직으로부터의 부상 신호 유도는 골격 줄기/전구 세포의 신속한 모집, 증식 및 후속 분화로 이어지며, 이는 골절의 전반적인 안정성 과 고정에 모두 중요합니다1. 특히, 골절 치유의 초기 단계는 주로 periosteal 상주 세포2에 기인하는 부드러운 callus 형성을 필요로한다2. 뼈가 다치면, periosteal 세포의 부분 집합은 급속하게 반응하고 periosteum 내의 명백한 골격 줄기/선조 세포 집단의 존재를 연루하는 callus3 내의 새로 분화한 연골 중간체 및 골에 기여합니다. 따라서, periosteum-거주자 골격 줄기 세포(SSC)의 식별 및 기능적 특성화는 퇴행성 뼈 질환 및 뼈 결함에 대한 유망한 치료 접근법을 구성한다4.
SSC는 골수를 포함하여 다중 조직 위치에 상주하는 것으로 생각됩니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다. 이러한 periosteal SSC (P-SSC)는 태아 뼈 발달 동안 초기 중간 엽 계보 마커 (즉, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 및 Axin2-CreER8)로 표시 될 수 있습니다4,7,8,9,10. 이러한 단일 유전 계보 추적 모델의 중요한 한계는 표지된 세포 집단 내의 상당한 이질성이 있다는 것입니다. 또한 라벨이 부착된 SSC를 생체 내에서자손과 구별할 수 없습니다. 이러한 제한을 해결하기 위해 최근 이중 리포터 마우스(Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+)를 개발하여 골수 SSC(BM-SSC)11에서 P-SSC를 뚜렷하게 시각화했습니다. 이 모델을 사용하면 P-SSC가 Mx1+αSMA+ 듀얼 라벨링으로 표시되는 반면, 보다 분화된 Mx1+ 세포는 골수, 내피 스텔스 및 페리오스핑 표면, 피질 및 궤적 골격11,12에 상주하는 반면, 더 분화된 Mx1+ 세포로 표시됩니다.
여러 사이토카인과 성장 인자는 뼈 리모델링 및 수리를 조절하는 것으로 알려져 있으며 중요한 세그먼트 결함1,13에서 골격 수리의 향상을 위해 테스트되었습니다. 그러나, 뼈 구획의 물리적 장벽의 중단을 통해 생성 된 부상 모델의 세포 복잡성으로 인해, 내인성 P-SSC 마이그레이션 및 치유 중 활성화에 이러한 분자의 직접적인 영향은 불분명하다. SSC의 기능적 특성 및 철새 역학은 종종 다른 세포 집단에서 이주를 유도하는 것으로 알려진 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 트랜스웰 또는 스크래치 분석을 수행함으로써 시험관 내에서 평가됩니다. 따라서, 생체 내 시스템에서 해당 되는 생체 내 시스템에서 적용을 위한 이러한 체외 실험의 결과 해석은 도전적이다. 현재, 골격 줄기/전구 세포 이동의 생체 내 평가는 전형적으로 실시간으로 관찰되지 않는다; 오히려, 그것은 골절 후 고정 된 시점에서 측정5,7,14,15,16.
이 방법의 제한은 마이그레이션이 단일 셀 수준에서 평가되지 않는다는 것입니다. 오히려 세포 집단의 변화를 통해 측정됩니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스의 생성에 있는 최근 발전 때문에, 개별 적인 세포의 생체 내 추적은 지금 가능합니다. 살아있는 동물 내 생명 현미경 을 사용하여, 우리는 Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스에 있는 24-48 시간 상해 내의 뼈 상해에 calvaria 봉합 틈새 틈새에서 P-SSCs의 명백한 이동을 관찰했습니다.
CCL5/CCR5는 최근 조기 부상 대응 중 채용 및 활성화 P-SSC에 영향을 미치는 규제 메커니즘으로 확인되었습니다. 흥미롭게도, 실시간으로 부상에 대한 응답으로 상당한 P-SSC 마이그레이션의 검출이 없었다. 그러나 CCL5로 부상을 치료하면 실시간으로 캡처할 수 있는 P-SSC의 강력하고 방향별 별다른 마이그레이션이 생성됩니다. 따라서, 이 프로토콜의 목적은 CCL5로 처리한 후에 실시간으로 P-SSC의 생체 내 이동을 기록하는 상세한 방법론을 제공하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뼈 치유 하는 동안, periosteal 세포는 새로 분화 된 연골 세포와 부상 callus3 내에서 골세포의 주요 소스입니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다. 내인성 P-SSC 기능적 특성을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 종종 SSC의 철새 역학은 시험관 내에서 평가되므로 생체 시스템?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 텍사스 상뼈 질환 프로그램, 캐롤라인 비스 법률 기금 상, 그리고 수상 번호 R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946에 수여 번호로 국립 보건 원의 NIAMS에 의해 지원되었다. BCM 광학 이미징 및 바이탈 현미경 코어와 BCM 첨단 기술 코어 의 M.E. 디킨슨과 T.J. Vadakkan에 NIH(AI036211, CA125123 및 DK056338)의 자금 지원을 제공합니다.
.
Materials
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
Referenzen
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
