Summary

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

Abstract

Periostale Skelettstammzellen (P-SSCs) sind für die lebenslange Knochenerhaltung und -reparatur unerlässlich und damit ein idealer Schwerpunkt für die Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Frakturheilung.  Periostzellen wandern schnell zu einer Verletzung, um neue Chondrozyten und Osteoblasten für die Frakturheilung zu liefern. Traditionell wurde die Wirksamkeit eines Zytokins zur Induktion der Zellmigration nur in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays durchgeführt. Mit Fortschritten in der intravitalen Mikroskopie unter Verwendung der Multiphotonenerregung wurde kürzlich entdeckt, dass 1) P-SSCs das Migrationsgen CCR5 exprimieren und 2) die Behandlung mit dem CCR5-Liganden, der als CCL5 bekannt ist, die Frakturheilung und die Migration von P-SSCs als Reaktion auf CCL5 verbessert. Diese Ergebnisse wurden in Echtzeit erfasst. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Visualisierung der P-SSC-Migration aus der kalvarialen Naht-Skelettstammzell-Nische (SSC) zu einer Verletzung nach der Behandlung mit CCL5. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion einer Mausfessel und einer bildgebenden Halterung, die chirurgische Vorbereitung der Mauskalvarie, die Induktion eines Calvaria-Defekts und die Erfassung der Zeitrafferbildgebung.

Introduction

Die Frakturreparatur ist ein dynamischer, mehrzelliger Prozess, der sich von der embryonalen Skelettentwicklung und dem Umbau unterscheidet. Während dieses Prozesses folgt auf die Induktion von Verletzungssignalen aus geschädigtem Gewebe die schnelle Rekrutierung, Proliferation und anschließende Differenzierung von Skelettstamm- / Vorläuferzellen, die alle für die Gesamtstabilität und Fixierung von Frakturen entscheidend sind1. Insbesondere erfordern frühe Stadien der Frakturheilung eine weiche Kallusbildung, die hauptsächlich auf periostale residente Zellen zurückgeführt wird2. Wenn Knochen verletzt werden, reagiert eine Untergruppe von Periostzellen schnell und trägt zu neu differenzierten Knorpelzwischenprodukten und Osteoblasten innerhalb des Kallus3 bei, was das Vorhandensein einer ausgeprägten Skelettstamm- / Vorläuferzellpopulation im Periost impliziert. Daher stellen die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der periostresidenten Skelettstammzellen (SSCs) einen vielversprechenden Therapieansatz für degenerative Knochenerkrankungen und Knochendefekte dar4.

Es wird angenommen, dass sich SSCs an mehreren Gewebestandorten befinden, einschließlich des Knochenmarks. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6.  Diese periostalen SSCs (P-SSCs) können während der fetalen Knochenentwicklung mit frühen mesenchymalen Lineage-Markern (d. h. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 und Axin2-CreER8) markiert werden4,7,8,9,10. Eine wesentliche Einschränkung dieser Modelle zur Verfolgung einzelner genetischer Abstammungslinien besteht darin, dass innerhalb der markierten Zellpopulationen eine erhebliche Heterogenität besteht. Darüber hinaus können sie markierte SSCs in vivo nicht von ihren Nachkommen unterscheiden. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir kürzlich eine Dual-Reporter-Maus (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) entwickelt, um P-SSCs aus Knochenmark-SSCs (BM-SSCs)11 deutlich sichtbar zu machen. Mit diesem Modell wurde festgestellt, dass P-SSCs durch Mx1+αSMA+-Doppelmarkierung gekennzeichnet sind, während sich differenziertere Mx1+-Zellen im Knochenmark, in endostalen und periostalen Oberflächen sowie in kortikalen und trabekulären Knochen befinden11,12.

Es ist bekannt, dass mehrere Zytokine und Wachstumsfaktoren den Knochenumbau und die Knochenreparatur regulieren und wurden auf die Verbesserung der Skelettreparatur bei kritischen Segmentdefekten getestet1,13. Aufgrund der zellulären Komplexität von Verletzungsmodellen, die durch die Störung der physikalischen Barriere des Knochenkompartiments entstehen, sind die direkten Auswirkungen dieser Moleküle auf die endogene P-SSC-Migration und -Aktivierung während der Heilung jedoch unklar. Die funktionellen Eigenschaften und die Migrationsdynamik von SSCs werden häufig in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays in Kombination mit Zytokinen oder Wachstumsfaktoren bewertet, von denen bekannt ist, dass sie die Migration in anderen Zellpopulationen induzieren. Daher ist die Interpretation der Ergebnisse dieser In-vitro-Experimente für die Anwendung in den entsprechenden in vivo-Systemen eine Herausforderung. Derzeit wird die In-vivo-Bewertung der Skelettstamm-/Vorläuferzellmigration in der Regel nicht in Echtzeit beobachtet; Vielmehr wird es zu festen Zeitpunkten nach der Fraktur gemessen5,7,14,15,16.

Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Migration nicht auf Einzelzellebene bewertet wird; Vielmehr wird es über Veränderungen der Zellpopulationen gemessen. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der intravitalen Mikroskopie lebender Tiere und der Erzeugung zusätzlicher Reportermäuse ist nun eine In-vivo-Verfolgung einzelner Zellen möglich. Unter Verwendung der intravitalen Mikroskopie von Lebendtieren beobachteten wir die deutliche Migration von P-SSCs aus der Calvaria-Nahtnnische zu einer Knochenverletzung innerhalb von 24-48 h nach der Verletzung bei Mx1/Tomato/αSMA-GFP-Mäusen.

CCL5/CCR5 wurde kürzlich als Regulierungsmechanismus identifiziert, der die Rekrutierung und Aktivierung von P-SSCs während des frühen Verletzungsreaktionsverhaltens beeinflusst. Interessanterweise wurde keine signifikante P-SSC-Migration als Reaktion auf eine Verletzung in Echtzeit festgestellt. Die Behandlung einer Verletzung mit CCL5 führt jedoch zu einer robusten, richtungsdifferierten Migration von P-SSCs, die in Echtzeit erfasst werden kann. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine detaillierte Methodik für die Aufzeichnung der In-vivo-Migration von P-SSCs in Echtzeit nach der Behandlung mit CCL5 bereitzustellen.

Protocol

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten und alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt. 1. Mausvorbereitung Kreuzen Sie Mx1-Cre17 und Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 Mäuse (gekauft vom Jackson Laboratory) mit αSMA-GFP-Mäusen (hier von Dr. Ivo Kalajzic und Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt), um Mx1-Cre+</…

Representative Results

Es wurde vorgeschlagen, dass Skelettvorläufer ein Migrations- oder Kreislaufpotenzial haben20. Kürzlich wurden Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) Reportermäuse erzeugt, bei denen P-SSCs durch Mx1+α SMA+ Doppelmarkierung gekennzeichnet sind (Abbildung 2A,B). Innerhalb von 24–48 h nach der Verletzung fand eine…

Discussion

Während der Knochenheilung sind Periostzellen die Hauptquelle für neu differenzierte Chondrozyten und Osteoblasten innerhalb einer Verletzungskalus3. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6. Die Bewertung der endogenen P-SSC-Funktionsmerkmale ist technisch anspruchsvoll. Oft wird die Migrationsdynamik von SSCs in vitro bewertet, was die Interpreta…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den Bone Disease Program of Texas Award, den Caroline Wiess Law Fund Award und das NIAMS der National Institutes of Health unter den Award-Nummern R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 bis D.P. unterstützt.  Wir danken M.E. Dickinson und T.J. Vadakkan im BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core und den BCM Advanced Technology Cores mit Mitteln von NIH (AI036211, CA125123 und DK056338).

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Materials

½” optical post ThorLabs TR2 For imaging mount
1 mL syringe BD 309659
27G needle BD PercisionGlide 305111
29G insulin syringe McKesson 102-SN05C905P
50 mL conicol tube Falcon 352098 For mouse restraint
Adjustable angle plate Renishaw R-PCA-5023-50-20 For imaging mount
Alcohol wipes Coviden 6818
betadine surgical scrub Henry Schen 67618-151-16
Buprenorphine SR-LAB ZooPharm 1mg/mL Sustained Release
Combo III Obtained from staff veterinarian N/A 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine
Coverslip Fisher 12-545-87 24 x 40 premium superslip
Fine tip forcepts FST 11254-20
Ketamine KetaVed 50989-161-06 100 mg/mL
Leica TCS SP8MP with DM6000CFS Leica Microsystems N/A
Matrigel R & D Systems 344500101
Medical tape McKesson 100199 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)
Methocellulose Electron Microscopy Sciences 19560
Microdissection scissors FST 1456-12
Motorized stage Anaheim automation N/A
Needle holder FST 12500-12
Nonabsorbable sutures McKesson S913BX monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle
Opthalmic ointment Rugby 0536-1086-91
RANTES Biolegend 594202 10 µg/50 µL
Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex ThorLabs RA90 For imaging mount
Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew ThorLabs TS25H For imaging mount
Sterile cotton swabs Henry Schen 100-9249
Sterile DPBS (1x) Corning 21-030-CV
Sterile drapes McKessen 25-517
Surgical gloves McKessen 3158VA
Triple antibiotic ointment Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer blood collection set BD REF 367298 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing

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Diesen Artikel zitieren
Ortinau, L., Lei, K., Jeong, Y., Park, D. Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice. J. Vis. Exp. (163), e61162, doi:10.3791/61162 (2020).

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