クリック可能な部分を持つモジュラーケージ化合物の光化学的特性の合成および測定のためのプロトコルが提示される。
ケージ化合物は、高い時空間分解能で細胞生理学の光媒介操作を可能にします。しかし、現在利用可能なケージ群の限られた構造的多様性と光凝集効率を犠牲にせずに合成改変の困難は、生細胞用ケージ化合物のレパートリーを拡大する障害であるアプリケーション。クマリン型光ケージ基の化学修飾は、多様な物理的および化学的特性を有するケージ化合物の調製に有望なアプローチであるとして、我々は、修飾することができるクリック可能なケージ化合物の合成のための方法を報告します銅(I)触媒ハウスゲンサイク化を介して様々な機能ユニットで簡単に。モジュラープラットフォーム分子は、フォトケイジング群として(6-ブロモ-7-ヒドロキシクーマリン-4-yl)メチル(Bhc)基を含み、従来の2-ニトロベンジルに比べて高い光分解効率を示す。アミン、アルコール、およびカルボキシレートを含むクリック可能なケージ化合物の調製のための一般的な手順が提示されます。水溶性および細胞標的化能力などの追加の特性は、クリック可能なケージ化合物に容易に組み込むことができる。さらに、光光化量子収率を含む物理的および光化学的特性を測定し、対応するBhcケージ化合物のものよりも優れていることが判明した。したがって、記載されたプロトコルは、利用可能なケージ化合物における構造的多様性の欠如に対する潜在的な解決策と考えることができる。
ケージ化合物は、元の機能が一時的にコバレントに取り付けられたフォトリムーバブル保護基によってマスクされる合成分子を設計されています。興味深いことに、生物学的に関連する分子のケージ化合物は、細胞生理学1、2、3、4、5の時空間制御に不可欠な方法を提供する 、6.1977年、エンゲルスとシュレーガーはcAMPの2-ニトロベンジルエステルをcAMP7の透過性およびフォトラビタール誘導体として報告した。翌年、カプランはATP(NPE-ATP)の1-(2-ニトロフェニル)エチルエステルを報告し、この化合物を「ケージ」ATP8と名付けた。それ以来、2-ニトロベンジル、p-ヒドロキシフェナシル9、2-(2-ニトロフェニル)エチル10、11、7-ニトロインドリン-1-イルス12などの光化学的に取り外し可能な保護基の範囲、 13、および(クマリン-4-yl)メチル14、15、16は、ケージ化合物の調製に使用されている。
膜透過性、水溶性、細胞標的化能力などの望ましい追加特性を有するケージ化合物の合成は、細胞生物学的応用を容易にすることが期待されるであろう。これらの分子の物理的および光化学的特性は、主にそれらを調製するために使用される光化学的に取り外し可能な保護基の化学構造に依存するため、光凝集基の多様なレパートリーが必要とされる。しかしながら、光光効率が高い現在利用可能なケジング群の構造的多様性は限られている。これは、ケージ化合物の使用を増やすための障害である可能性があります。.
この問題に対処するために、フォトケージング群のレパートリーは、既存のフォトリムーバブル保護群の化学的修飾または優れた光物理的および光化学的特性を有する新しいフォトラビル染色体の設計によって拡大された。例としては、ニトロジベンゾフロン(NDBF)17、[3-(4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)-2-ブチル](DMNPB)18、19、カルシウム感受性2-ニトロベンジルフォト20、置換クマリニルメチル(DEAC450),DEAdcCM22,7-アゼチジニル-4-メチルカマリン23,及びスチルル・クマリン24,シアニン誘導体(CyEt-pan)25、およびBODIPY誘導体26,27。
また、以前に(6-ブロモ-7-ヒドロキシクーマリン-4-yl)メチル(Bhc)群を開発し、神経伝達物質28、第2メッセンジャー29、30、および様々なケージ化合物の合成に成功しました。オリゴヌクレオチド31、32、33は、大きな1つ及び2光子励起断面を示す。追加の特性は、その光過敏性を損なうことなくケージグループに簡単にインストールすることができれば、ケージ化合物のレパートリーを拡張することができます34,35,36,37、38、39.したがって、我々は3つの部分、すなわち写真応答性コアとしてBhcグループ、追加機能のインストールのための化学ハンドル、およびマスクされるべき分子40を含むモジュラーケージ化合物を設計しました。41.
したがって、この記事は、生物学的に関連する分子のケージ化合物の調製のための実用的な方法を提供する。本プロトコルは、フォトケージ群のためのクリック可能なプラットフォームの準備のための方法、ケージ化合物のレパートリーを拡大するための追加機能の導入、その物理的および光化学的測定について説明します。さらなる細胞応用のためのクリック可能なケージ化合物の細胞型選択的ターゲティング。
我々は以前に、高い光溶解効率28、45、46、47を示す様々な生物学的活性分子のBhcケージ化合物を開発した。Bhcケージ群のレパートリーを拡大することを目的として、様々な機能ユニット32、40、41の導入により容易に改変できるモジュラーケージ化合物のプラットフォームも報告した。したがって、本プロトコルは、銅(I)-触媒Huisgen環化を介して修飾することができるBhcケージング基のクリック可能な前駆体の合成のための方法を表す。クリック可能な前駆体paBhcCH2OH(2)の合成は、市販の4ブロモレソルシノール(図1A)から始まる4段階の反応配列を介して達成された。本プロトコルの利点は、手間のかかる精製工程(例えば、カラムクロマトグラフィー分離)が必要とされていないことである。
クリック可能な前駆体paBhcCH2OH(2)は、種々の官能基をマスクするために使用することができるので、アミン、アルコール、およびカルボキシリ酸のクリック可能なケージ化合物を前駆体として2を用いて合成した(図1B)。アルコールは炭酸塩として改変され、アミンはカルバメートとして改変された。一般的な手順1および2では、CDIをクリック可能なカルバメートの調製に使用し、4-ニトロフェニルクロロフォルマーメートは炭酸塩の調製に用いた。反応機構によって示されているように、両方の試薬は、カルバメートおよび炭酸塩の調製に使用することができる。また、所望のケージ化合物の収率は、ケージされる分子の化学構造に依存することにも留意すべきである。その他の例は、以前のレポート28、30、33、48で見ることができます。
次に、報告された手順49のわずかな変更を用いてクリック修正を行った。トリス(トリアゾリルメチル)アミン系リガンドの添加は、良好な高収率で所望の製品を得るために必要である。様々なアジドが商業的な供給源と文献のプロシージャの両方から容易に入手可能であるため、水溶性や細胞標的化能力などの追加特性を有する様々なモジュラーケージ化合物を調べることができます(図2)。
光光の量子収率は、次に報告された手順28、50に従って測定した。図3は、2°glc-paBhcmoc-PTXの光溶解消費量とPTXの放出が、それぞれ単一指数減衰と上昇によって近似されたことを示し、放射線または望ましくない二次効果の内部フィルタリングを示唆していない。改善された光光量量子収率(Φ)および光凝集効率(εΦ)は、以前に報告されたBhcケージ化合物と比較してクリック可能なpaBhcケージ化合物について観察された(表1)41、 43.Bhcケージ化合物の光凝膜効率(εΦ)は、2-ニトロベンジル型ケージ化合物48の100倍以上であるので、paBhcケージ群の存在による顕著な改善は明らかにこのシステムの利点。
概念実証実験として、親水性部分を2~paBhcmoc-PTX(4)に導入し、化合物3に細胞標的化リガンドを導入した(図2)。2°glc-paBhcmoc-PTXの水溶性は、親PTXの650倍高かった(表1)。タグプローブシステムを用いて選択的細胞標的化を達成し、ハロタグリガンドを有するpaBhcmoc-hex-FITC/Halo(8)は、ハロタグ/EGFR融合タンパク質を発現する培養哺乳動物細胞の細胞膜に標的化することに成功した(図 4)。キナーゼの細胞内局在化の光媒介変調も、クリック可能なケージ化合物5を用いて達成された(図5)。
結論として、水溶性や細胞などの追加特性で容易に改変できる生物学的に興味深い分子のフォトケージ化合物のクリック可能なプラットフォームの調製方法の実証に成功しました。ターゲティング能力。paBhc caging群は、変更可能な官能基を有する任意の分子を調製するために使用することができるので、本プロトコルの適用は、本明細書に記載される分子に限定されない。モジュラープラットフォーム、すなわちpaBhcケージグループを使用して、所望のケージ化合物を簡単に調製することができ、その物理的および化学的特性は、クリック修飾を介して変調することができます。
The authors have nothing to disclose.
本研究は、JSPS KAKENHI助成金番号JP16H01282(TF)、革新的分野の科学研究助成金「メモリーダイナミズム」、JP19H05778(TF)、「MolMovies」の支援を受けました。
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |