클릭 가능한 케이지 화합물의 설계, 합성 및 광화학적 특성

1. 클릭 가능한 케이지 화합물을 위한 모듈식 케이지 paBhc 그룹의 합성28,41 제제 (6-브로모-7-하이드록시쿠마린-4-yl)메틸 클로라이드 (Bhc-CH2Cl) 교반기가 장착된 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 4-브로모어소르시놀(9.742 g, 51.5 mmol)을 놓습니다. H2 SO4(98%, 30 mL)를 플라스크에 넣고 혼합물을 저어 녹입니다. 에틸 4-클로로아세테이트(10 mL, 74 mmol)를 드롭와이즈에 넣으세요. 혼합물을 주변 온도에서 5일 동안 계속 저어줍니다. 별도로 으깬 얼음 조각(~200 mL)을 500 mL 에를렌마이어 플라스크에 넣습니다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고 미세하게 가루침이 얻을 때까지 30 분 동안 힘차게 저어줍니다. 진공 여과를 통해 침전물을 수집합니다. 밝은 갈색 침전물을 물로 5 번 씻으소서. 밤새 진공 하에서 침전물을 건조하여 bhcCH2Cl을 연갈색 분말(13.57 g, 46.9 mmol)으로 산출한다. 메탄올 (6-브로모-7-하이드록시쿠마린-4-yl)의 제조 (BhcCH2OH) 준비된 BhcCH2Cl(1.1440 g, 3.95 mmol)과 1M HCl(300 mL)을 딤로스 콘덴서가 장착된 둥근 바닥 플라스크 1L에 놓습니다. 혼합물을 140°C에서 5일간 저어줍니다. 이 시간 후, 주위 온도에 혼합물을 냉각. 진공 하에서 회전 증발에 의한 반응으로부터 물을 제거하여bhcCH2OH(1)를 연갈색 분말(1.0359 g, 3.82 mmol, 97% 수율)으로 산출한다.참고: bhcCH2Cl 1g당 1M HCl의 250mL를 사용하면 만족스러운 결과를 제공합니다. 만니치 반응을 통한 paBhcCH2OH (2)의 제조 파라포름알데히드(446.4 mg, 14.9 mmol)를 50 mL 의 둥근 바닥 플라스크에 놓습니다. 플라스크에 무수 에탄올(5 mL)과 N-메틸프로파르가밀(1.25 mL, 14.8 mmol)을 첨가합니다. 혼합물을 주변 온도에서 1시간 동안 저어줍니다. 플라스크에 bhcCH2OH(1)(1.367 g, 5.04 mmol)를 추가합니다. 혼합물을 블록 히터 장치로 80°C로 가열하고, Ar 분위기 하에서 2시간 동안 80°C에서 혼합물을 계속 교반한다. 블록 히터를 중지하고 실온으로 반응 혼합물을 냉각. 진공 여과에 의해 생성 된 밝은 갈색 – 노란색 침전물을 수집합니다. 소량의 무수 에탄올 (매번 1 mL)으로 침전제를 두 번 씻으하십시오. 진공 하에서 여분의 에탄올을 제거하여 paBhcCH2OH(2)(1.393 g, 3.96 mmol)를 산출한다. 2. 클릭 가능한 케이지 화합물의 준비 참고: 다음 절차는 하이드록실, 아미노 및 카르복실레이트 작용기를 함유한 다른 클릭 가능한 케이지 화합물의 제조에 적용될 수 있습니다. 일반 절차 1 : 클릭 할 수있는 케이지 아민의 준비 paBhcCH2OH(2)(709.6 mg, 2.02 mmol) 및 N,N’-카본 디이미다졸 (CDI, 397.6 mg, 2.45 mmol)을 30 mL 의 둥근 바닥 플라스크에 놓습니다. 건조한CH2Cl2(6mL)를 넣고 주변 온도에서 1시간 동안 저어줍니다. 4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP, 324.8 mg, 2.66 mmol)과 테르트-부틸(6-아미노헥실)카르바메이트(533.1 mg, 2.46 mmol)를 첨가합니다. 용액을 주변 온도에서 3시간 동안 저어줍니다. 진공 하에서 회전 식 증발기로 용매 및 기타 휘발성 물질을 제거하십시오. 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다. 일반 절차 2 : 클릭 할 수있는 케이지 알코올의 준비 파클리탁셀(PTX, 48.7 mg, 0.057 mmol)을 30mL 의 둥근 바닥 플라스크에 3방향 스톱콕과 Ar 풍선이 장착된 곳에 놓습니다. 건조CH2Cl2 (1 mL), 4-DMAP (17.1 mg, 0.14 mmol), 및 4-니트로페닐 클로로포메이트 (26.0 mg, 0.13 mmol)를 추가하십시오. 주위 온도에서 2.5시간 동안 Ar 대기하에서 용액을 저어줍니다. 용액에 4-DMAP(15.7 mg, 0.13 mmol) 및 paBhcCH2OH(2)(39.1 mg, 0.111 mmol)를 첨가합니다. 혼합물을 주변 온도에서 17 시간 동안 계속 저어줍니다. CHCl3(10 mL) 및 15% 수성 NaHCO3(5 mL)을 혼합물에 첨가합니다. 약 3분 간 혼합물을 힘차게 저어줍니다. 유기층을 함유한 플라스크에 0.5M 구연산(5 mL)을 첨가합니다. 혼합물을 저어 서 위와 같이 수성 층을 제거합니다. 위상 분리 컬럼을 사용하여 유기층을 분리합니다. 진공 하에서 회전 식 증발기로 용매를 제거하십시오. 표준 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 제품을 정화합니다. 일반 절차 3 : 클릭 할 수있는 케이지 카복실산의 준비 아라키돈산(33.0 μL, 0.100 mmol), paBhcCH2OH(2)(39.6 mg, 0.112 mmol) 및 4-DMAP(14.1 mg, 0.115 mmol)을 드라이CH2Cl2(2 mL)에 용해시. N, N.isopropylcarbodiimide (DIPC, 17.0 μL, 0.110 mmol)를 추가하고 140 분 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다. 진공 상태의 용매를 제거합니다. 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다. 3. 클릭 가능한 케이지 화합물에 기능 단위 설치 구리(II) 황산 펜타하이드레이트(249 mg)를 이온 교환수(IEW, 10 mL)에 용해하여 0.1 M CuSO4 용액을 부여한다. 용해 2시-paBhcmoc-PTX (8.0 mg, 6.5 μmol), 트리스 (3-하이드록시프로필리아졸메틸)아민(THPTA, 17.5 mg, 40.3 μmol), 나트륨 L-아스코르브산나트륨 (162.4 mg, 0.825 mmol), 및 15-클로로-3,6,9-trioxapentadecyl 아지드 (3.1 mg, 11 μmol) 0.1 M 인산염의 혼합 용매에 버퍼 (2.5 mL, pH 7.2) 및 디메틸 설폭사이드 (DMSO, 0.5 mL). 반응 혼합물에 0.1 M CuSO4 용액(81.2 μL, 8.1 μmol)을 첨가한다. 혼합물을 주변 온도에서 80 분 동안 저어 줍니다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 반응의 진행 상황을 모니터링하십시오. 75% 아세토니트릴/물 용액(3.5 mL)을 추가하여 침전물을 용해시더드합니다. 생성된 용액을 반준비 HPLC 시스템에 직접 적용하여 원하는 제품을 정화합니다.참고 : 테르트-부탄올을 첨가하여 반응 혼합물의 용용화는 반응의 진행을 가속화 할 수 있습니다. 4. 케이지 화합물의 광내성 무분열 반응 재고 솔루션 준비 원하는 케이지 화합물(5 μmol)을 DMSO(500 μL)에 용해하여 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 각 용액(10 μL)의 알리쿼트(aliquot)를 1.5mL 미세원원지 튜브에 분배하고 사용하기 직전까지 냉동고(−20°C)에 보관하십시오. 6 mM K3[Fe(C2O4)3] (100 mL): 80 mL의 물에 재결정 된 폴리옥살산염 (0.295 g, 0.675 mmol)을 용해하십시오. 0.5 M H2SO 4(10mL)와 적당량의 IEW를 추가하여 부피를 100mL로 구성합니다.참고 : 칼륨 페리 옥살산은 뜨거운 물에서 재결정화를 통해 정제하고 어둠 속에서 저장해야합니다. 재결정된 칼륨 페리옥살레이트는 트리하이드레이트로서 수득된다; 따라서, 그 수식은K3[Fe(C2 O4)3]··3H2O및491.24의 분유 중량을 고려하여 재고용액의 제조시에 고려되어야 한다. 510 nm에서 흡수를 측정하여 6 mM 용액의 순도를 확인하십시오. 흡광도가 <0.02인 경우, 실험에 사용하기에 적합하다. 0.1% 버퍼 펜 (30 mL): 용해 NaOAc·3H2O (7.35 g), 1,10-페난트랄린 (페난트린)· H2O(30 mg) 및 IEW(20 mL)에서H2SO 4(0.9 mL)를 conc. H. IEW를 추가하여 볼륨을 30mL로 구성합니다.참고 : 용액은 1.8 M NaOAc, 0.54 M H2SO4및 0.1 % 1,10 페난트린을 포함합니다. 페리옥살레이트 작용법을 이용한 광자 수 측정 석영 큐벳에 6mM K3[Fe(C2 O4)3](V1 L)을 놓습니다. 5s에 대한 350 nm 빛으로 용액을 조사하십시오. 조사된 용액을 l[cm] 경로 길이의 파이렉스 큐벳으로 옮긴다. 조사된 샘플 용액에 0.1% 버퍼-phen(V2 L)을 추가하고 파이펫팅을 통해 잘 섞습니다. 510 nm에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 단위 시간당 평균 흡수 변화를 계산합니다(ΔA510 [s-1]). 다음 방정식에 따라 단위 시간당 생성된 Fe2+ 이온의 두더지 수를 계산합니다.nFe2+ [몰s-1]= (((((V1 + V2)[L] × ΔA510 [s-1])//(l[cm] × θ510 [L 몰-1 cm-1]),여기서(V1 +V2)는흡수 측정을 위한 시료의 부피이고, l은 큐벳의 광학 경로 길이이고, θ510은 Fe2+의어금니 흡수성이다- 510 nm에서 펜 복합체.참고: 일반적인 실험 조건에서 V1 = 2.0 × 10-3 L, V2 = 0.33 × 10-3 L, l = 1.0 cm, θ510 = 1.1 × 104 L mol-1 cm-1을 사용했습니다. 다음 수식을 사용하여샘플(I0)에도달하는 광자의 두더지 수를 계산합니다.I0 [아인슈타인 cm-2 s-1]= nFe2+ /Φ350Φ 350은 350 nm에서 페리옥살산염의 광감소의 양자 효율이다.참고: 350 nm에서 의 칼륨 페리옥살산염 액티노미터의 양자 효율은 보고되지 않았지만, 358 nm에서 1.2542의 보고값이 사용되었다. 350 nm에서 양자 효율 측정 시료 스톡 용액(DMSO, 10 μL)을 K-MOPS 버퍼(pH 7.2, 10 mL)로 희석하여 0.1% DMSO를 함유하는 K-MOPS에서 10 μM 용액을 부여하였다.참고: K-MOPS 완충액은 100 mM KCl 및10 mM 3-(N-morpholino) 프로판설포닉산(Mops)으로 구성되었으며, KOH를 사용하여 pH 7.2로 적정화되었다. 화학 작용계의 광반응에 사용된 동일한 큐벳에용액(V1 L)의 aliquot를 전송합니다. 4.2.1단계에서 설명한 것과 동일한 설정을 사용하여 샘플 용액을 조사합니다. 조사된 용액으로부터 aliquot(50 μL)를 주기적으로 제거하고 HPLC를 사용하여 분석합니다. 시작 물질의 90%가 반응하는 조사시간(t90%)을결정하여 시작 물질의 시간 의존적 실종의 플롯을 피팅한다.참고: 방사선의 내부 여과가 무시될 수 있도록 조사된 샘플의 흡광도는 <0.1로 유지되어야 합니다. 원조 물질의 광분석 소비량은 단일 지수 붕괴에 의해 근사화될 수 있으므로 광용해 과정을 방해하는 바람직하지 않은 보조 효과가 없는 것이 바람직합니다. 다음 수학식28을사용하여실종(Φdis)의양자 수율을 계산합니다.Φ디스 = 1/(t90% × I0 × σ350)여기서 t90% [s]는 시작 물질의 90%가 소비된 조사 시간이며, I0[아인슈타인cm-2 s-1]은광자의 두더지 수, σ 350[cm]입니다. 2 mol-1]은350 nm에서 샘플의 데카딕 소멸 계수입니다.참고 : σ350 [cm2 몰-1] = 103θ350 [M-1cm -1]. 5. HaloTag 리간드가 있는 클릭 가능한 케이지 화합물 타겟팅 참고: 사용하기 전에, 10% 항생제(스트렙토마이신 황산염, 페니실린 G, 암포테리신)를 함유한 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM, 저당, 피루바트, L-글루타민)에서 HeLa 세포를 유지하십시오. 37 °C 및 5%CO2. 배지를 제거하고 트립신-에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA, 1 mL)을 37°C에서 1분간 1분간 처리하여 세포를 트립시니화시키고, 세포에 DMEM(4 mL)을 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시한다. DMEM (2 mL) 24 시간 전에 35mm 유리 바닥 접시에 접시 당 약 5 × 105 세포를 씨앗. 4개의 접시에 대해, 1.5 mL 마이크로원심분리튜브에서, 감소된 혈청 배지(700 μL)에서 플라스미드 DNA(pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg)를 희석한다. 별도로, 감소된 혈청 배지(150 μL)에서 지방 흡입 시약(5 μL)을 각각 4개의 튜브에 희석하고 주위 온도에서 5분 동안 방치합니다. 희석된 플라스미드 DNA(150 μL)의 일부를 각각의 희석된 지방흡입 시약 샘플에 첨가한다. 주변 온도에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 37°C 및 24시간 동안 5%CO2에서 유지한 후, DMEM을 흡인하고 인산완충식염수(PBS, 2 mL)로 세포를 헹구었다. 감소된 혈청 배지(1.5 mL)를 추가합니다. 각 접시에 플라스미드-리포페션 시약(150 μL) 복합제를 첨가합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 유지한다. 배지를 흡인하고, 2 μM paBhc-HEX-FITC/Halo를 함유하는 갓 제조된 DMEM(1 mL)의 일부를 첨가하고, 37°C및 5%CO2에서 30분 동안 세포를 배양한다. 케이지된 화합물을 함유하는 배지를 흡인하고 PBS+(린스당 1 mL)로 세포를 두 번 헹구어 언바운드 화합물을 제거한다. 환원된 혈청 배지(500 μL)를 첨가하고 세포를 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 배양하여 세포에 들어간 화합물을 제거하였다.참고 : PBS +는 인산염 버퍼링 식염수 2 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2로보충되었습니다. 배지를 제거하고 PBS+(1mL)로 세포를 두 번 헹구십시오. 페놀 레드를 포함하지 않는 배지(1 mL)의 일부를 추가합니다. 레이저 스캐닝 공초점 형광 현미경검사법에 의해 형광 이미지를 기록합니다. 6. 클릭 가능한 케이지 화합물을 사용하여 키나아제 현지화의 광중재 변조 참고: 사용하기 전에 Ham’s F-12 배지에 CHO-K1 세포를 37°C및 5%CO2에서10% FBS로 보충하여 유지하십시오. DMSO에서 paBhc-AA(5)의 100배작업 용액(1mM)을 준비합니다.참고: 화합물의 10 mM 스톡 용액을 냉동고(-20°C)에 제조 및 저장한다. DMEM (2 mL) 24 시간 전에 35mm 유리 바닥 접시에 접시 당 약 5 × 105 세포를 씨앗. GFP-DGKγ 48시간 전에 플라스미드 코딩을 가진 조-K1 세포를 무분별한 실험전에 트랜스펙트.참고: 형질감염은 5.2-5.5 단계에 따라 수행됩니다. 배지를 감소된 혈청 배지(2mL)로 교체합니다. 100× paBhc-AA 작업 용액 (20 μL)을 추가하고 5 분에서 1 시간 사이에 37 °C 및 5 %CO2에서 세포를 배양하십시오.참고: 로딩 시간은 사용되는 화합물에 따라 다릅니다. 이중 광원 형광 조명기가 장착된 반전형광 현미경의 객관적인 단계에 세포를 놓습니다. 10초마다 형광 영상을 찍습니다. 또는 유연한 석영 섬유를 통해 Xe 램프를 사용하여 405 nm 빛으로 셀을 조사합니다. 형광 등 이미지를 10분 동안 계속 기록합니다.