可点击笼体化合物的设计、合成和光化学特性

1. 可点击笼化合物的模块化笼式paBhc组合成28，41 制备（6-溴-7-羟基古马林-4-基）甲基氯化物（Bhc-CH2Cl） 将 4-布罗莫索西诺 （9.742 g， 51.5 mmol） 放入配备搅拌棒的 100 mL 圆底烧瓶中。 在烧瓶中加入H2SO 4（98%，30 mL），搅拌混合物溶解。 滴滴加入乙基4-氯乙酸酯（10 mL，74 mmol）。 继续在环境温度下搅拌混合物5天。 另外，将碎冰块（约200 mL）放入500 mL Erlenmeyer 烧瓶中。 将反应混合物倒入冰中，用力搅拌30分钟，直到获得细粉沉淀物。 通过真空过滤收集沉淀物。用清水洗涤浅棕色沉淀物五次。 在真空下干燥沉淀物过夜，产生 BhcCH2Cl 作为浅棕色粉末 （13.57 g， 46.9 mmol）。 制备（6-溴-7-羟基古马林-4-yl）甲醇（BhcCH2OH） 将准备好的 BhcCH2Cl（1.1440 g、3.95 mmol）和 1 M HCl（300 mL）放入配备 Dimroth 冷凝器的 1 L 圆底烧瓶中。在140°C下搅拌混合物5天。在此时间后，将混合物冷却至环境温度。 在真空下通过旋转蒸发将水从反应中去除，以产生 BhcCH2OH （1） 作为浅棕色粉末（1.0359 克，3.82 mmol，97% 收率）。注：每1克BhcCH2Cl使用250 mL 1 M HCl，结果令人满意。 通过曼尼奇反应制备 paBhch2OH （2） 将甲醛（446.4毫克，14.9毫摩尔）放入50mL圆底烧瓶中。在烧瓶中加入无水乙醇（5 mL）和N-甲基丙二醇（1.25 mL，14.8 mmol）。 在 Ar 气氛下，在环境温度下搅拌混合物 1 小时。 将 BhcCH2OH （1） （1.367 g， 5.04 mmol） 添加到烧瓶中。使用块式加热器装置将混合物加热至 80°C，并在 Ar 气氛下在 80°C 下继续搅拌混合物 2 小时。 停止块加热器，并将反应混合物冷却至室温。 通过真空过滤收集产生的浅棕色-黄色沉淀物。用少量无水乙醇（每次1 mL）清洗沉淀物两次。 在真空下去除多余的乙醇，以产生paBhch2OH （2） （1.393克，3.96毫摩尔）。 2. 可点击的笼体化合物的制备 注：以下程序可应用于制备含有羟基、氨基和碳化物功能组的其他可点击的笼状化合物。 一般程序1：制备可点击的笼式胺 将 paBhch2OH （2） （709.6毫克， 2.02 毫摩尔） 和N，N’-碳基二甲酰二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯醚 （ CDI， 397.6 mg， 2.45 mmol） 放入 30 mL 圆底烧瓶中。加入干 CH2Cl2 （6 mL），并在环境温度下搅拌溶液 1 小时。 加入4-二甲基氨基甲酰胺（4-DMAP，324.8毫克，2.66毫摩尔）和三丁基（6-氨基）碳水化合物（533.1毫克，2.46毫摩尔）。在环境温度下搅拌溶液 3 小时。 在真空下使用旋转蒸发器去除溶剂和其他挥发性材料。直接使用硅胶闪光柱色谱法净化残留物。 一般程序2：制备可点击的笼式酒精 将 paclitaxel （PTX， 48.7 mg， 0.057 mmol） 放入一个 30 mL 圆底烧瓶中，配有三向止热孔和 Ar 气球。加入干CH2Cl2 （1 mL）、4-DMAP（17.1毫克，0.14毫摩尔）和4-硝基氯丁二酯（26.0毫克，0.13毫摩尔）。 在Ar气氛下，在环境温度下搅拌溶液2.5小时。 在溶液中加入4-DMAP（15.7毫克，0.13毫摩尔）和paBhch2OH （2） （39.1毫克， 0.111毫摩尔）。在环境温度下继续搅拌混合物 17 小时。 在混合物中加入 CHCl3 （10 mL） 和 15% 水性 NaHCO3 （5 mL）。大力搅拌混合物约3分钟，用移液器去除水层。 在含有有机层的烧瓶中加入0.5M柠檬酸（5 mL）。搅拌混合物并清除上述水层。 使用相分离柱分离有机层。在真空下用旋转蒸发器去除溶剂。使用标准硅胶闪光柱色谱法净化产品。 一般程序3：制备可点击的笼状卡状酸 在干CH2Cl2 （2 mL） 中溶解阿希辛酸 （33.0 μL， 0.100 mmol）， paBhch2OH （2） （39.6 mg， 0.112 mmol） 和 4-DMAP （14.1 毫克， 0.115 mmol）。加入N，N+-二丙基卡迪米德（DIPC，17.0 μL，0.110 mmol），并在环境温度下搅拌溶液140分钟。 在真空下去除溶剂。直接使用硅胶闪光柱色谱法净化残留物。 3. 将功能单元安装到可点击的笼体中 在交流水（IEW，10 mL）中溶解硫酸铜（II）五水合物（249毫克），以给出0.1M CuSO4溶液。 溶解 2°-paBhcmoc-PTX （8.0 毫克， 6.5 μmol）、三s（3-羟丙基三氧化二甲酯）胺（THPTA，17.5毫克，40.3μmol），乙酸钠（162.4毫克，0.825毫摩尔）和15-氯-3，6，9-三聚氰胺（3.1毫克，11μmol），混合溶剂0.1 M缓冲液（2.5 mL，pH 7.2）和二甲基亚硫酸盐（DMSO，0.5 mL）。 将0.1M CuSO4溶液（81.2μL，8.1μmol）加入反应混合物。在环境温度下搅拌混合物80分钟。使用高性能液相色谱法（HPLC）监测反应的进度。 通过加入75%的乙酰乙酯/水溶液（3.5 mL）溶解沉淀物。将所得溶液直接应用于半准备HPLC系统，以纯化所需产品。注：通过添加三丁醇使反应混合物的溶解可以加速反应的进展。 4. 笼内化合物的光溶性未密封反应 准备库存解决方案 将所需的笼体化合物（5μmol）溶解在DMSO（500μL）中，制备10 mM库存溶液。将每种溶液（10 μL）的等分分配到1.5 mL微离心管中，并储存在冷冻室（+20°C）中，直到使用前。 6 mM K3[Fe （ C2O4）3] （100 mL）： 在 80 mL 水中溶解再结晶的铁氧酸钾 （0.295 g， 0.675 mmol）。加入 0.5 M H2SO4 （10 mL） 和适当数量的 IEW，以将音量补至 100 mL。注：铁氧酸钾应通过热水再结晶进行纯化，并储存在黑暗中。再结晶的铁氧酸钾作为三水合物获得;因此，其公式为 K3+Fe （C2O4）3=3H2O，在制备库存溶液时应考虑 491.24 的公式权重。通过测量 510 nm 的吸收，检查 6 mM 溶液的纯度。如果吸光度为 <0.02，则适用于实验。 0.1% 缓冲-苯 （30 mL）： 溶解 NaOAc+3H2O （7.35 g）， 1，10-苯甲苯 （phen）*H2O （30 mg） 和康克 H2SO4 （0.9 mL） 在 IEW （20 mL）。添加 IEW 以将音量补到 30 mL。注：该溶液含有1.8M NaOAc、0.54 M H2SO4和0.1%1，10-苯丙环。 使用铁氧体量测定法测量光子数 将 6 mM K3[Fe （C2O4）3= （V1 L） 放入石英色皿中。用 350 nm 光照射溶液，为 5 s。 将辐照溶液转移到具有l [cm] 路径长度的 Pyrex 比色皿中。 在辐照样品溶液中加入0.1%缓冲液（V2 L），通过移液进行良好混合。测量样品在 510 nm 处的吸光度。计算单位时间的平均吸收变化 （+A510 [s]1]）。 根据以下公式计算每单位时间生成的 Fe2+离子的摩尔数：nFe 2= [摩尔 s +1] （（（ V1 + V2） [L] = = A 510 [s]）/）其中 （V1 + V2） 是用于吸收测量的样品体积，l是比色皿的光路长度，而 ±510是 Fe2+的摩尔吸收 -在510纳米的苯复合物。注：在典型的实验条件下，V1 = 2.0 × 10±3 L，V 2 = 0.33 × 10±3 L，l = 1.0厘米，+510 = 1.1 × 10 4 L mol=1使用 cm#1。 使用以下公式计算到达样本的光子摩尔数 （I0）：I0 [爱因斯坦 cm] 2 s+1= nFe2]/=350其中# 350是 350 nm 处铁氧酸盐光还原的量子效率。注：虽然未报告350nm处铁氧酸钾作用计的量子效率，但在358nm时采用报告值1.2542。 350 nm 的量子效率测量 用K-MOPS缓冲液（pH 7.2，10 mL）稀释样品库存溶液（在DMSO，10μL中），在含有0.1%DMSO的K-MOPS中提供10μM溶液。注：K-MOPS缓冲液由100 mM KCl和10 mM3-（N-变形）丙烷酸（Mops）组成，用KOH至pH 7.2。 将溶液（V1 L）的等分转移到化学活性计的光反应中使用的同一色比色皿中。使用步骤 4.2.1 中描述的相同设置照射示例解决方案。 定期从辐照溶液中取出等分（50 μL），并使用HPLC进行分析。 确定辐照时间（以秒为单位），其中 90% 的起始材料通过拟合起始材料的时间依赖性消失的地块而发生反应（t90%）。注： 辐照样品的吸光度必须保持在 <0.1，以便忽略辐射的内部滤波。最好通过单指数衰减来近似起始材料的光解消耗，这样没有干扰光解过程的意外次效应。 使用以下方程28计算消失 （*dis） 的量子产量：[dis ] 1/（t90% × I0 × =350） 其中t90% [s] 是消耗 90% 起始材料的辐照时间，I 0 [爱因斯坦 cm= 2 s+1]是光子摩尔数，而 ±350 μcm2 mol+1= 是 350 nm 处样品的分度消光系数。注：Φ350 [厘米2摩尔+ 1] = 103×350 [M+ 1厘米+ 1] 5. 以可点击的笼状化合物为目标，带有光环配体 注：使用前，在Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM，低葡萄糖，丙酸钠，l-谷氨酰胺）中保持HeLa细胞，并辅以含有1%抗生素（硫酸链霉素、青霉素和氨基林）的10%胎儿牛血清（FBS），37 °C 和 5% CO2. 在37°C下用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，1 mL）处理1分钟，取出培养基并胰蛋白酶化细胞。在转染前24小时，将每盘种子5×105个细胞放入35毫米玻璃底盘中，24小时。 对于四个菜肴，在1.5 mL微离心管中，在减少的血清培养基（700μL）中稀释质粒DNA（pcDNA3-Halo-EGFR，14 μg）。另外，将减少的血清介质（150 μL）中的唇裂试剂（5 μL）稀释到四个管中，使其在环境温度下站立5分钟。 在每个稀释的唇裂试剂样品中加入一部分稀释的质粒DNA（150 μL）。在环境温度下孵育5分钟。 在37°C和5%CO2保持细胞24小时后，吸出DMEM，用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞（PBS，2 mL）。加入减少的血清培养基（1.5 mL）。 将质粒-利菲菲特试剂（150 μL）复合物添加到每道菜中。将细胞保持在37°C和5%CO248小时。 吸气培养基，加入含有2μM paBhc-FITC-TO-Halo的新鲜制备的DMEM（1 mL）部分，并在37°C和5%CO2下孵育细胞30分钟。 吸出含有笼体化合物的培养基，用PBS+冲洗细胞两次（每次冲洗1 mL），以去除任何未结合的化合物。加入减少的血清介质（500μL），在37°C和5%CO2孵育细胞30分钟，以去除进入细胞的化合物。注： PBS+ 是磷酸盐缓冲盐水补充 2 mM CaCl2和 1 mM MgCl2。 取出介质，用 PBS+ （1 mL） 冲洗细胞两次。加入不含苯酚红的介质（1 mL）。通过激光扫描共聚焦荧光显微镜记录荧光图像。 6. 使用可点击的笼体化合物对激酶定位进行光介调制 注：使用前，在火腿的F-12介质中保持CHO-K1细胞，在37°C和5%CO2下辅以10%的FBS。 在 DMSO 中准备 100° 工作溶液 （1 mM） 的 paBhc-AA （5）。注：该化合物的10 mM库存溶液制备并储存在冰柜中（-20°C）。 在转染前24小时，将每盘种子5×105个细胞放入35毫米玻璃底盘中，24小时。 转熟CHO-K1细胞，在解处理实验前为GFP-DGK®48h进行质粒编码。注： 转染根据步骤 5.2_5.5 执行。 用减少的血清培养基（2 mL）替换培养基。加入100°paBhc-AA工作溶液（20μL），在37°C和5%CO2孵育细胞5分钟至1小时之间。注： 装载时间取决于所使用的化合物。 将细胞置于装有双光源荧光照明器的倒置荧光显微镜的客观舞台上。 每10s拍摄一次荧光图像，用330~385nm光照射细胞，在适当的时间内通过显微镜物镜照射。或者，使用 Xe 灯通过柔性石英纤维用 405 nm 光照射电池。 继续录制荧光图像 10 分钟。