エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

エクソソームは nanovesicles (30 サイズに至るまで 150 nm nm) 細胞間コミュニケーションを促進する^1,2を処理する人間の体のほぼすべてのセルが発表しました。興味深いことに、エクソソームの組成は、起源の細胞だけでなく、個々 の^3,4、5の状態に応じて変更します。また、エクソソームから取得できるいくつかの生物学的流体など: 唾液、尿、血²。これらの機能によりエクソソームは病のバイオ マーカーの良い情報源と見なされます。残念ながら、エクソソームの隔離のための標準的な方法はありません。いくつかの研究所では、多段遠心、エキソソーム分離法のゴールド スタンダードとしての密度勾配を使用して 100,000 × g で最後の高速ステップを検討してください。しかし、最近の研究はその遠心水溶性タンパク質とエクソソームとエキソソーム整合性、どちらが下位アプリケーション^{6,7 を妨げる可能性がありますに影響を与えるだけでなく、他のエクソソームの凝集を誘導する示されています。}.エキソソーム分離の他の一般的な方法に限定されない: 商業ポリエチレング リコール (PEG) 沈殿物ベースの試薬、遠心限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)。ポリエチレング リコール (PEG) 高分子を用いた市販の試薬に沈殿し、ペレットを形成させることによりエクソソームを豊か。このポリマーを使用して制限は、残留ペグ ポリマーと最終製品に可溶性の非 exosomal 蛋白質の豊富な汚染です。限外濾過を利用して浄化し、セルロース膜を使用して小胞を集中する遠心分離小さい不純物や他のタンパク質が膜^7、8を通過中、エクソソームはフィルター上保持されます。他の方法と同様遠心限外濾過法非 exosomal 蛋白質、タンパク質凝集体などの高レベルの保持のためエクソソームを浄化するために限られた能力があります。最後に、SEC の浄化は、サイズによって分子を分離するのに多孔質樹脂を使用します。SEC は有望な結果を示している汚染タンパク質の大部分をキャプチャして以来、分離のに基づいて重力または低圧システム^{7、exosomal の整合性を維持する他の方法で直面している問題のほとんどを克服します。 9}。ただし、秒の中に大きいタンパク質凝集体とリポタンパク質¹⁰の共同分離最終エキソソーム準備の純度に影響します。エキソソーム浄化のみプラズマ^9,11やプラズマ⁷、細胞培養上清からのいくつかのメソッドがテストされている間血を直接比較するメソッドのパフォーマンスに関する情報がないです。プラズマと同じ個人からの血清。

ここでは、様々 な小胞濃縮技術はプラズマと血清の翻訳可能なかどうかを決定するためのワークフローを比較することによって血中エクソソームの浄化に着目します。ナノ粒子追跡分析および西部のしみは、最終製品におけるエキソソーム濃度、純度、およびタンパク質組成の違いを定量化する使用されました。最後のメソッドは、このプロトコルの詳細は小胞の数の増加し、非 exosomal 蛋白質のレベルを減らします。重要なは、一般的な共同沈降蛋白質アルブミンやアポ蛋白などの大幅な削減が示されています。血と、彼ら共同浄化エクソソームと原因矛盾下流解析の傾斜「浄化」のサンプル周波数でこれら 2 つのタンパク質の高い豊富。このプロトコルを含む市販秒樹脂;樹脂多孔質ビーズ 700 kDa より小さい蛋白質がビーズを入力することができますで構成されます。一度中、蛋白質は octylamine リガンドによって保持されます。溶出液はエクソソームと 700 kDa¹²よりも大きい分子から成る。また、タンパク質凝集体とビーズのトラップを回避するとアポリポタンパクを減らすために、我々 はワークフローのプロテアーゼ消化手順を含めます。現在がない単一の技術共同浄化非 exosomal 蛋白質を削減しながらエキソソーム収量を最大化することができます。本研究を示しますエキソソーム収量および血清および血漿から純度を高めるため複数の回復そして浄化の方法がプロテアーゼ消化前処理を組み合わせた浄化のプロトコルが使えます。