Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes são nanovesicles (variando em tamanho de 30 nm a 150 nm) lançado por quase todas as células no corpo humano facilitar a comunicação célula a célula processa^1,2. Curiosamente, a composição do exosomes muda dependendo das células de origem, bem como o estado de saúde do indivíduo^3,4,5. Além disso, exosomes pode ser obtido em vários fluidos biológicos tais como: saliva, urina e de sangue². Devido estas características, exosomes são considerados para ser uma boa fonte de biomarcadores da doença. Infelizmente, não há nenhum método padrão para a isolação de exosomes. Alguns laboratórios consideram centrifugação várias etapas, com uma etapa final de alta velocidade a 100.000 x g usando gradientes de densidade, como o método padrão-ouro para exossomo isolamento. No entanto, estudos recentes têm mostrado que ultracentrifugação induz agregação de exosomes com proteínas solúveis e outras exosomes, além de afetar a integridade do exossomo, ambos os quais podem dificultar a aplicações a jusante^6,7 . Outros métodos comuns de isolamento do exossomo incluem, mas não estão limitados a: precipitação por comercial polietileno glicol (PEG) com base em reagentes, ultrafiltração centrífuga e cromatografia de exclusão-tamanho (SEC). Os reagentes comerciais usando polímeros de polietileno glicol (PEG) enriquecem exosomes, causando-lhes para precipitar e formar um pellet. Limitações de utilização deste polímero são contaminação residual polímero PEG e uma abundância de proteínas solúveis não-exosomal no produto final. Ultrafiltração utiliza centrifugação para purificar e concentrar-se vesículas usando uma membrana de celulose; exosomes são mantidos acima do filtro, enquanto as impurezas menores e outras proteínas atravessam a membrana^7,8. Assim como outros métodos, ultrafiltração centrífuga tem uma capacidade limitada para purificar exosomes devido a manutenção de altos níveis de proteínas não-exosomal, incluindo agregados e complexos da proteína. Finalmente, purificação SEC usa resina porosa para separar moléculas por tamanho. SEC tem mostrado resultados promissores, superando a maioria dos problemas experientes com outros métodos, capturando a maioria das proteínas contaminantes e preservando a integridade exosomal, desde que o isolamento é baseado na gravidade ou sistemas de baixa pressão^{7, 9}. No entanto, o isolamento co de proteínas maiores agregados e lipoproteínas¹⁰ durante o SEC afeta a pureza da preparação final exossomo. Enquanto alguns métodos foram testados para a purificação do exossomo de sobrenadantes de cultura de células e plasma⁷ou apenas plasma^9,11, não há nenhuma informação sobre o desempenho dos métodos diretamente comparando o sangue plasma e soro do mesmo indivíduo.

Aqui, focalizamos a purificação do sangue exosomes, comparando uma variedade de fluxos de trabalho para determinar se as técnicas de enriquecimento de vesículas são traduzíveis entre plasma e soro. Nanopartículas, acompanhamento, análise e borrão ocidental foram usadas para quantificar as diferenças na composição de concentração, a pureza e a proteína exossomo em produtos finais. O método final, detalhado no presente protocolo, aumenta o número de vesículas e reduz os níveis de proteína não-exosomal. Importante, uma redução drástica das proteínas co precipitantes comuns, incluindo albumina e apolipoproteínas é demonstrada. A abundância destas duas proteínas no sangue e a frequência em que eles co purificam com exosomes causas inconsistências entre as amostras “purificadas”, desviando as análises a jusante. Este protocolo inclui o uso de uma resina SEC comercialmente disponível; a resina é composta de grânulos porosos em que proteínas menores que 700 kDa podem inserir os grânulos. Uma vez dentro, as proteínas são retidas por um ligante de octylamine. O eluato é composto de exosomes e moléculas maiores que 700 kDa¹². Além disso, a fim de reduzir a proteína agregados e apolipoproteínas que evade armadilhas do grânulo, incluímos um protease digestão passo do fluxo de trabalho. Atualmente, não existe única técnica capaz de maximizar o rendimento do exossomo reduzindo co purificação proteínas não-exosomal. Este estudo mostra que um protocolo de purificação que combina um pré-tratamento de digestão de protease com vários métodos de purificação e recuperação pode ser usado para aumentar o rendimento do exossomo e pureza de sangue soro e plasma.