Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Exosomes sont nanovesicles (allant de 30 nm à 150 nm) publié par presque toutes les cellules dans le corps humain pour faciliter la communication de cellule-cellule traite^1,2. Fait intéressant, la composition des exosomes change suivant les cellules d’origine ainsi que l’état de santé de l’individuel^3,4,5. En outre, les exosomes peuvent être extraites de plusieurs fluides biologiques tels que : salive, l’urine et de sang². Grâce à ces caractéristiques, exosomes sont considérés comme une bonne source de biomarqueurs de la maladie. Malheureusement, il n’y a aucune méthode standard pour l’isolement des exosomes. Certains laboratoires considèrent centrifugation plusieurs étapes, avec une dernière étape à grande vitesse à 100 000 x g utilisant des gradients de densité comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de l’exosome. Toutefois, des études récentes ont montré qu’ultracentrifugation induit agrégation des exosomes avec protéines solubles et autres exosomes, en plus d’affecter l’intégrité de l’exosome, qui risquent d’entraver les applications en aval^6,7 . Autres méthodes courantes d’isolement de l’exosome comprennent, mais ne se limitent pas à : précipitation par commercial polyéthylène glycol (PEG) base réactifs, ultrafiltration centrifuge et chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Les réactifs commerciaux utilisant des polymères de polyéthylène glycol (PEG) enrichissent les exosomes en obligeant à précipiter et former une boulette. Limites à l’aide de ce polymère sont contamination résiduelle PEG polymère et une abondance de protéines solubles non-exosomal dans le produit final. Ultrafiltration utilise centrifugation pour purifier et concentrer les vésicules à l’aide d’une membrane de cellulose ; exosomes sont conservés au-dessus du filtre, tandis que les plus petites impuretés et autres protéines traversent la membrane^7,8. Tout comme les autres méthodes, ultrafiltration centrifuge a une capacité limitée pour purifier les exosomes en raison du maintien de niveaux élevés de protéines non-exosomal, y compris les agrégats et les complexes protéiques. Enfin, purification SEC utilise une résine poreuse pour séparer les molécules selon la taille. SEC a montré des résultats prometteurs, surmontant la plupart des problèmes expérimentés avec d’autres méthodes en capturant la majorité des protéines contaminant et en préservant l’intégrité exosomal, étant donné que l’isolement est fondé sur la gravité ou de systèmes dépressionnaires^{7, 9}. Toutefois, l’isolement Co de protéines plus gros agrégats et les lipoprotéines¹⁰ pendant SEC affecte la pureté de la préparation de l’exosome final. Alors que certaines méthodes ont été testées pour la purification de l’exosome de surnageants de culture de cellules et plasma⁷ou seulement plasma^9,11, il n’y a aucune information sur la performance des méthodes comparant directement le sang plasma et sérum de la même personne.

Ici, nous nous concentrons sur la purification du sang exosomes en comparant une variété de flux de travail pour déterminer si les techniques d’enrichissement de vésicules sont traduisibles entre le sérum et le plasma. Nanoparticules, suivi, analyse et tache occidentale ont été utilisées pour quantifier les différences dans la composition de concentration, la pureté et protéine exosome dans les produits finaux. La dernière méthode, détaillée dans le présent protocole, augmente le nombre de vésicules et réduit les niveaux de protéines non-exosomal. Ce qui est important, une réduction drastique des protéines co précipitants communes dont l’albumine et apolipoprotéines est démontrée. La grande abondance de ces deux protéines dans le sang et la fréquence à laquelle ils purifient conjointement avec exosomes causes des incohérences entre les échantillons « purifiés », les analyses en aval de l’inclinaison. Ce protocole comprend l’utilisation d’une résine SEC disponible dans le commerce ; la résine est composée de perles poreux dans lequel protéines inférieures à 700 kDa peuvent entrer dans les perles. Une fois à l’intérieur, les protéines sont retenus par un ligand octylamine. L’éluat est composé de molécules supérieure à 700 kDa¹²et les exosomes. En outre, afin de réduire les agrégats de protéines et apolipoprotéines qui se soustraire de piégeage de la perle, nous incluons une étape de digestion de protéase dans le workflow. Actuellement, il n’y a aucune technique unique capable de maximiser l’exosome rendement tout en réduisant les co purification de protéines non-exosomal. Cette étude montre qu’un protocole de purification qui combine un prétraitement de digestion de protéase avec plusieurs méthodes de récupération et la purification peut être utilisé pour augmenter le rendement exosome et la pureté du sérum de sang et de plasma.